Luận Văn Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử phát hiện gen quy định hàm lượng amylose ở lúa

PHẦN I. MỞ ĐẦU
Hiện nay một trong những chỉ tiêu đánh giá chất lượng của một giống lúa đó là hàm lượng amylose (AC) cao, thấp hay trung bình. Với những giống lúa cho gạo có hàm lượng amylose cao thường lâu chín, cơm khô và cứng khi để nguội, gạo có hàm lượng amylose thấp hoặc rất thấp thường dính không tơi cơm, trong khi đó gạo có hàm lượng amylose trung bình thường tơi cơm ăn không ráp và không cứng khi để nguội nên được người tiêu dùng ưa chuộng. Do đó chọn tạo các giống hàm lượng amylose trung bình là vấn đề cấp thiết.
Cùng với sự phát triển nhanh chóng của công nghệ sinh học và tin học đã cho phép chúng ta tiếp cận các yếu tố liên quan quyết định chất lượng lúa gạo ở mức phân tử, đặc biệt hàm lượng amylose. Hiểu rõ bản chất cấu trúc chức năng của các yếu tố quy định sự hình thành và biến đổi của amylose trong hạt gạo ở cấp độ phân tử sẽ cho phép chúng ta, các nhà khoa học, nhà chọn giống ứng dụng vào nghiên cứu và chọn tạo các giống mới có năng suất, chất lượng với hàm lượng amylose hợp lý. Dựa trên cơ sở đó chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử phát hiện gen quy định hàm lượng amylose ở lúa”

Mục đích và yêu cầu

- Khảo sát đánh giá một số chỉ tiêu cơ bản liên quan đến hàm lượng amylose của các giống địa phương.
- Xác định gen waxy quy định hàm lượng amylase ở hạt gạo bằng maker phân tử.
PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Các nghiên cứu đã chỉ ra một số enzyme chủ yếu tham gia tổng hợp tinh bột: ADP glucophosphate synthetase (AGPase) hoạt hoá glucose 1 phosphate thành ADP glucose (Pressis et al 1991). Granule – bound starch synthase (GBSS) gắn các ADP – glucose vào đoạn mồi bắt đầu từ đầu không khử bằng liên kết 1-4 glycozid. Enzym SBE cắt chuỗi liên kết 1-4 glucan và tạo liên kết α – (1-6)glucan tạo nên các phân tử amylopectin. Enzyme Ganule bound starch synthase GBSS được mã hoá bởi gene Wx ở nhiễm sắc thể số 6 (Okagaki wessler 1988). Soluble starch synthase (SSS) cũng có tác động đến sự tạo mạch nhánh. Tuy nhiên SBE có vai trò chủ yếu tới sự tổng hợp amylopectin
Trình tự của gene Wx trên giống O. Sativa (Japonica Heng-feng) dài 5499 bp gồm 14 Exon, 13 Intron (Wang, et al 1990); Trên cơ sở hàm lượng GBSS trong các loài non-Waxy, đã tìm thấy 2 alen Waxy là Wxa, Wxb lần lượt trên loài phụ Indica và Japonica, còn ở lúa nếp là alen lặn wx (Sano 1980). Một số nghiên cứu khác cũng chỉ ra rằng trên locus Wx có ít nhất 3 alen có chức năng khác nhau Wxa, Wxb, wx lần lượt trong các loài Indica, Japonica và lúa nếp (Sano, 1984).
Khi so sánh giữa 2 alen Wxa và Wxb Y. Sano, M.Kasumata (1986) thấy rằng Wxa tăng cường hoạt động của GBSS, do đó làm tăng hàm lượng amylose trong nội nhũ hạt hơn so với Wxb. So sánh trình tự Wxb và Wxa cho thấy có sự thay thế một nu G bởi T tại vị trí cắt nối intron 1 (trình tự cắt nối từ đầu 5’ của intron 1 của Wxa là AGGTATA, của Wxb là AGTTATA). Kết quả làm giảm hàm lượng mRNA thành thục dẫn đến giảm GBSS tạo thành, từ đó giảm hàm lượng amylose (Sano 1984, Hirano 1998).
Hiro- Yuki Hirano và cs (1998) sử dụng tế bào trần để nghiên cứu chức năng gen waxy thông qua sự biểu hiện của gen gus, kết hợp phân tích Nothern blot. Kết quả cho thấy với loài mang gen Wxa có quá trình sao mã cao và gen GUS hoạt động mạnh, với loài mang gene Wxb thì cho mức hoàn thành quá trình sao mã giảm và gene GUS hoạt động yếu. Trên cơ sở đó tác giả đã phân các loài lúa theo mức tiến hoá được thể hiện ở hình 9. Hai loài O. barthii và O. Rufipogon đều có kiểu gene Wxa, hàm lượng amylose cao, được hình thành từ tổ tiên hoang dại của chúng cũng mang gene Wxa và cho hàm lượng amylase cao. Loài phụ O. glaberrima mang gene Waa được tiến hóa từ O. barthii. Hai loài phụ O. sativa indica và O. sativa japonica có tổ tiên là O. Rufipogon, nhưng indica mang gene Wxa với hàm lượng amylose cao còn loài japonica mang kiểu gen có chứa đột biến Wxb cho hàm lượng amylase trung bình.

Khi xác định trình tự lặp TC (TC repeats) Hirano và cs sử dụng SSR và nhân lên trình tự microsatellite DNA có chứa trình vùng nu đột biến ở đầu 5’ intron 1. Hình 6

Tại Việt Nam, các nhà chọn giống ở đồng bằng sông Cửu Long đã sử dụng MAS trong chọn giống lúa có hàm lượng amylose thấp và trung bình trên cơ sở ứng dụng microsatellite marker liên kết rất chặt với gen Waxy (Nguyễn Thị Lang, 2004 )

PHẦN III. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1.Vật liệu nghiên cứu: Sử dụng 40 giống lúa địa phương được lưu giữ trong tập đoàn giống của khoa Công Nghệ Sinh Học - Trường Đại Học Nông Nghiệp –Hà Nội.
3.2. Nội dung nghiên cứu
3.2.1. Đánh giá các chỉ tiêu chất lượng gạo của một số giống lúa địa phương: nhiệt hoá hồ, độ bền gel, và hàm lượng amylose.
3.2.2.Sử dụng chỉ thị phân tử phát hiện gen quy định hàm lượng amylose của một số giống địa phương.
3.3. phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Phương pháp đánh giá các chỉ tiêu chất lượng gạo
Nhiệt hoá hồ
Lấy 6 hạt gạo đã xát trắng, không có vết nứt, gãy, sắp vào đĩa petri. Cho vào mỗi đĩa 10 ml dung dịch KOH 1.7%, đậy nắp và để trong 23 giờ ở nhiệt độ 30oC. Nhiệt trở hồ được xác định bằng mức lan rộng và độ trong suốt của gạo sau khi xử lý (theo phương pháp của Little và cs). Đánh giá nhiệt hoá hồ và độ phân huỷ theo thang điểm IRRI.(1996)