Báo Cáo Nghiên cứu ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong phát hiện sớm và dự báo tiên lượng của ung t

CHƯƠNG TRÌNH KHCN CẤP NHÀ NƯỚC KC 10-06
BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI
NĂM 2010
MỤC LỤC ( Báo cáo dài 151 trang)

MỤC LỤC .
DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ .Chương I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3
1.1. Tình hình dịch tễ bệnh ung thư gan trên thế giới .3
1.2. Tình hình dịch tể ung thư gan tại Việt nam .3
1.3. Các yếu tố nguy cơ gây ung thư gan 4
1.4. Một số hiểu biết về HBV .5
1.4.1. Cấu trúc của HBV 5
1.4.2. Cơ chế nhân lên của HBV .10
1.4.3. Cơ chế bệnh sinh của HBV 12
1.4.4. Cơ sở của sự đa dạng bộ gen HBV 14
1.4.5. Mối liên quan giữa nhiễm HBV với UTG .16
1.4.5.1. Vai trò của các protein HBV trong sinh bệnh học ung thư gan .16
1.4.5.2. Kiểu gene HBV trong sinh bệnh học ung thư gan .16
1.4.5.3. Hiện tượng tái tổ hợp kiểu gene và đồng/bội nhiễm hơn một kiểu gene trong bệnh do nhiễm HBV .17
1.4.5.4. Vai trò của đột biến gene HBV và nồng độ HBV DNA trong ung thư gan 17
1.4.5.5. Tương tác giữa bộ gene HBV với gene người 18
1.5. Các phương pháp chẩn đoán ung thư gan hiện nay 19
1.6. Các dấu ấn phân tử có giá trị trong chẩn đoán ung thư gan 20
1.6.1. Alpha-fetoprotein đặc hiệu (HS-AFP) ung thư gan và mRNA của nó (Hepatoma specific AFP và AFP-mRNA) .21
1.6.2. Gene ức chế u P53 .22
1.6.3. IFN receptor .23
1.6.4. DNA lưu hành tự do 24
1.6.5. Một số dấu ấn của HBV có giá trị trong chẩn đoán UTG .25
1.7. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng các dấu ấn phân tử trong chẩn đoán UTG tại Việt Nam .28

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP .
2.1. Đối tượng .30
2.1.1. Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân ung thư gan .30
2.1.2. Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân viêm gan B mạn tính .30
2.1.3. Tiêu chuẩn lựa chọn người mang HBV mạn tính không triệu chứng 31
2.1.4. Tiêu chuẩn loại trừ .31
2.1.5. Địa điểm lấy mẫu .31
2.2. Phương pháp .31
2.2.1. Thu thập bệnh nhân và số liệu nghiên cứu 31
2.2.2. Thu thập mẫu bệnh phẩm .32
2.2.3. Định lượng nồng độ HBV DNA 34
2.2.4. Phương pháp xác định kiểu gene HBV 37
2.2.4. Giải trình tự gene pre-S 43
2.2.5. Giải trình tự gene pre-Core 47
2.2.6. Giải trình tự gene HBX 47
2.2.7. Giải trình tự gene vùng khởi động nhân 48
2.2.8. Phương pháp xác định đột biến gene P53 49
2.2.9. Phương pháp xác định đột biến gene mã hóa thụ thể IFN (IFN R) .49
2.2.10. Định lượng nồng độ HBX trong huyết tương 50
2.2.11. Định lượng AFP mRNA 51
2.2.12. Định lượng mRNA GP73 53
2.2.13. Định lượng DNA lưu hành tự do trong huyết tương (GSTP1) 55
2.2.12. Phương pháp hóa mô miễn dịch 55
2.2.13. Phương pháp nghiên cứu chức năng của đột biến gen HBx phân lập từ bệnh nhân UTG 58
2.2.14. Phân tích thống kê 60

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU. .61
3.1. Đặc điểm chung các nhóm nghiên cứu .61
3.1.1. Đặc điểm về tuổi và giới 61
3.1.2. Đặc điểm của một số xét nghiệm cận lâm sàng của các nhóm nghiên cứu .61
3.2. Nồng độ HBV DNA trên các nhóm nghiên cứu .62
3.2.1. So sánh nồng độ HBV DNA trên các nhóm nghiên cứu .62
3.2.2. So sánh nồng độ HBV DNA trên các nhóm tại thời điểm đưa vào nghiên cứu và thời điểm kết thúc .63
3.3. Kiểu gene HBV trên các nhóm nghiên cứu 64
3.3.1. Phân bố kiểu gene HBV trên 190 đối tượng nghiên cứu .64
3.3.2. Mối liên quan giữa kiểu gene với mức độ tổn thương gan tại thời điểm đưa vào nghiên cứu .66
3.4. Đột biến gene Pre S 68
3.4.1. Các loại đột biến gene Pre S được tìm thấy .68
3.4.2. So sánh tần suất xuất hiện đột biến gene pre-S nói chung trên các nhóm nghiên cứu .70
3.4.3. So sánh các loại đột biến trên các nhóm nghiên cứu .71
3.4.4. So sánh đột biến gene giữa nhóm có và không có ung thư 72
3.5. Đột biến gene vùng khởi động nhân và HBX .72
3.5.1. Một số hình ảnh đột biến điển hình .72
3.5.2. So sánh tỷ lệ đột biến tại vùng khởi động nhân và HBX trên các nhóm nghiên cứu .74
3.5.3. So sánh tỷ lệ đột biến trên các nhóm có và không có ung thư gan 75
3.6. Đột biến gene vùng tiền nhân (pre Core) 76
3.6.1. Một số hình ảnh điển hình của đột biến vùng tiền nhân 76
3.6.2: So sánh tỷ lệ đột biến tại vùng tiền nhân trên các nhóm nghiên cứu .77
3.6.3. So sánh tỷ lệ đột biến trên các nhóm có và không có ung thư gan 78
3.7. Đột biến gene P53 của tế bào 78
3.7.1 Hình ảnh đột biến gene P53 điển hình 78
3.7.2. So sánh tỷ lệ đột biến gene P53 trên các nhóm nghiên cứu .79
3.7.3. So sánh tỷ lệ đột biến gene P53 trên 2 nhóm: ung thư và không ung thư .80
3.8. Đột biến gene IFN alpha R .80
3.9. Biến đổi nồng độ GSTP1 83
3.9.1. Nồng độ GSTP1 khi đưa vào nghiên cứu 83
3.9.2. So sánh nồng độ GSTP1 tại thời điểm đưa vào nghiên cứu và kết thúc nghiên cứu .84
3.10. Biến đổi mRNA GP73 85
3.10.1. So sánh mức độ biểu hiện gene GP-73 giữa các nhóm bệnh nhân và nhóm khoẻ mạnh 85
3.10.2. So sánh mức độ biểu hiện gene GP-73 giữa các nhóm nghiên cứu .86
3.10.3. So sánh giá trị chẩn đoán của mức độ biểu hiện gene GP-73 với AFP .86
3.11. Kết quả định lượng AFP mRNA 87
3.11.1. Kết quả kiểm định chất lượng và khối lượng của RNA tổng số 87
3.12.2. Kết quả địng lượng AFP mRNA trên các nhóm nghiên cứu .88
3.12.3. So sánh tỷ lệ % các mẫu dương tính với AFP mRNA trên các nhóm nghiên cứu .89
3.12. Biến đổi HBx–protein .90
3.12.1. Tần suất xuất hiện HBx-protein trong huyết tương bệnh nhân .90
3.11.2. Tái tổ hợp và biểu lộ HBx-protein đột biến phân lập từ bệnh nhân UTG. 91
3.9.3. HBx-protein đột biến và chủng dại tăng cường hoạt hóa NF-kB 92
3.11. Các phương pháp chẩn đoán sớm UTG 94

Chương 4: BÀN LUẬN .95
4.1. Đặc điểm chung các nhóm nghiên cứu .100
4.1.1. Đặc điểm về tuổi và giới 100
4.1.2. Đặc điểm cận lâm sàng của các nhóm nghiên cứu 101
4.2. Nồng độ HBV DNA trên các nhóm nghiên cứu .102
4.3. Kiểu gene HBV trên các nhóm nghiên cứu 104
4.4. Đột biến gene Pre S 109
4.5. Đột biến gene vùng khởi động nhân và HBX .112
4.6. Đột biến gene vùng tiền nhân (pre Core) 114
4.7. Đột biến gene P53 .118
4.8. Đột biến gene IFN alpha R .120
4.9. Giá trị của DNA lưu hành tự do trong chẩn đoán UTG 122
4.10. Biến đổi mRNA GP73 124
4.11. Vai trò của HBx-protein trong chẩn đoán UTG .125
4.12. Các phương pháp chẩn đoán sớm UTG trên bệnh nhân nhiễm HBV .127
KẾT LUẬN 132
KIẾN NGHỊ .135
TÀI LIỆU THAM KHẢO .136
ĐẶT VẤN ĐỀ
Ung thư tế bào gan nguyên phát (viết tắt là UTG) hay là ung thư biểu mô tế bào gan (Hepatocellular Carcinoma, HCC) là bệnh lý thường gặp đứng hàng thứ 5 trên thế giới, có tỷ lệ tử vong đứng hàng thứ 3 trong các tử vong liên quan đến ung thư [1], [2].
UTG thường được chẩn đoán xác định ở giai đoạn muộn khi có triệu chứng như biểu hiện mệt mỏi, đau bụng, gầy sút cân, thậm chí khi đã có khối
khu trú sờ được trên thành bụng, khi có tổn thương tế bào gan hoặc muộn hơn khi không còn khả năng can thiệp phẫu thuật cũng như sử dụng các phương pháp trị liệu khác [3]. Nguyên nhân chẩn đoán UTG muộn là do sự hạn chế về các phương pháp phát hiện hiện nay. Các phương pháp chẩn đoán UTG đang được sử dụng tại các cơ sở y tế bao gồm: khám xét lâm sàng phát hiện thấy gan to, đau, gầy sút cân nhanh , các xét nghiệm máu phát hiện dấu ấn ung thư AFP, siêu âm, X quang, nội soi, chụp cắt lớp vi tính (CT scanner), cộng hưởng từ (Magnetic Resonany Imaging, MRI), sinh thiết gan chẩn đoán mô bệnh học .
Tuy nhiên, tất cả các phương pháp trên thường phát hiện được UTG ở giai đoạn muộn của bệnh. Khi đó các biện pháp can thiệp điều trị ít mang lại hiệu quả, thời gian sống của bệnh nhân sau khi chẩn đoán UTG chỉ kéo dài từ 6 tháng đến 1 năm. Vì vậy, nghiên cứu tìm hiểu các dấu ấn sinh học, các biện pháp chẩn đoán mới để phát hiện sớm và tiên lượng UTG là nhu cầu cần thiết hiện nay. Kết quả các nghiên cứu trước đây đã chứng minh nhiễm virut viêm gan B (HBV) là nguyên nhân chủ yếu gây UTG. Tuy nhiên không phải tất cả các bệnh nhân nhiễm HBV đều tiến triển thành UTG. Nhiễm HBV có thể gây viêm gan cấp tính tự hồi phục, hoặc tiến triển thành viêm gan mạn tính, xơ gan, viêm gan ác tính, hoặc trở thành người mang HBV mạn tính không triệu chứng [4].
Nguyên nhân nào dẫn đến sự khác biệt đó vẫn còn nhiều tranh luận. Liên quan đến UTG người ta thấy rất nhiều các bệnh nhân được phát hiện bệnh một cách tình cờ, nghĩa là UTG thường xuất hiện trên các bệnh nhân trước đây hoàn toàn khỏe mạnh nhưng mang HBV mạn tính không triệu chứng.
UTG cũng như tất cả các bệnh ung thư khác nói chung là hậu quả của biến đổi nhiều gene, tương tác qua lại của nhiều protein, DNA trong các tế bào. Do đặc điểm bộ gene và vòng đời của HBV có liên quan chặt chẽ đến sự hình thành UTG nên việc tìm ra các dấu ấn phân tử của HBV như đột biến gene, mức độ biểu hiện gene HBV và gene người là một trong những hướng nghiên cứu đang rất được quan tâm [4].
Việt Nam là nước có người nhiễm HBV đứng hàng cao nhất thế giới, tỷ lệ HBsAg (+) ở người lớn khoẻ mạnh từ 10 – 20% có nơi lên tới 26% [5]. Như vậy, ước tính có hơn 10 triệu người đang mang HBV mạn tính ở nước ta và nguy cơ phát sinh UTG ở những người này là rất lớn.
Do đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài này nhằm các mục tiêu sau:
1. Xác định tỷ lệ và mối liên quan giữa đột biến gene của HBV và bệnh nhân ung thư tế bào gan nguyên phát.
2. Xác định các phương pháp phát hiện sớm ung thư tế bào gan nguyên phát trên bệnh nhân nhiễm HBV.