Báo Cáo Nghiên cứu ứng dụng các kỹ thuật di truyền hiện đại trong chẩn đoán và tiên lượng một số bệnh ung th

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI
NĂM 2011
MỤC LỤC ( Báo cáo dài 340 trang)
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Mục tiêu 3
Trong ung thư ĐTT 3
Trong carcinôm tuyến vú . 4
Trong bệnh bạch cầu 4
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 6
1.1 Những khái niệm cơ bản về di truyền ung thư 6
1.2.Các loại gen liên quan ung thư 7
1.2.1 Tiền gen sinh ung và gen sinh ung 7
1.2.2 Gen đè nén u . 15
1.2.3 Gen sửa lỗi bắt cặp sai (MMR gene) 22
1.2.4 Gen liên quan đến phát triển u - Ki67 . 23
1.3 Nghiên cứu di truyền ung thư 25
1.3.1 Các nghiên cứu về dấu ấn khối u 25
1.3.2 Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật di truyền phân tử . 27
1.4. Tổng quan về carcinôm tuyến ĐTT 28
1.4.1- Các thể carcinôm tuyến ĐTT . 28
1.4.2 Các con đường đột biến gen dẫn tới carcinôm tuyến ĐTT . 30
1.4.3 Đặc điểm của carcinôm tuyến ĐTT 33
1.4.4 Các xét nghiệm sàng lọc . 34
1.4.4.1 Các triệu chứng mới xuất hiện . 34
1.4.4.2 Thăm khám trực tràng bằng ngón tay 35
1.4.4.3 Tìm máu ẩn trong phân 35
1.4.4.4 Nội soi đại tràng chậu hông . 36
1.4.4.5 Nội soi toàn bộ đại tràng 36
1.4.4.6 Chụp đối quang kép đại tràng 37
1.4.4.7 Các chiến lược sàng lọc carcinôm tuyến ĐTT trong dân số 37
1.5 Tổng quan về carcinôm tuyến vú 39
1.5.1 Những nét đặc trưng của carcinôm tuyến vú 39
1.5.2 Đặc điểm bệnh học carcinôm tuyến vú gia đình . 43
1.5.3 Phân loại carcinôm tuyến vú . 50
1.5.4 Giai đoạn. 52
1.5.5 Độ mô học . 52
1.5.6 Các yếu tố tiên lượng . 53
1.6 Tổng quan về bệnh bạch cầu 54
1.6.1 Lược sử và khái quát về ứng dụng của di truyền học tế bào/ sinh học
phân tử trong bệnh bạch cầu 54
1.6.2. Bạch cầu mạn dòng tủy 57
1.6.3 Bạch cầu cấp dòng tủy 64
1.6.4 Bạch cầu cấp dòng lymphô . 69
1.7. Gia hệ và yếu tố di truyền trong bệnh ung thư 74
1.7.1 Trong ung thư đại – trực tràng 77
1.7.2 Trong ung thư vú . 78
1.7.3 Leukemia . 80
1.8. Tình hình nghiên cứu carcinôm tuyến vú, ĐTT và bệnh bạch cầu ở Việt Nam 80

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 84
2.1 Thiết kế nghiên cứu 84
2.1.1 Carcinôm tuyến ĐTT và carcinôm tuyến vú . 84
2.1.2 Bệnh bạch cầu . 84
2.2 Đối tượng nghiên cứu 84
2.2.1 Carcinôm tuyến ĐTT 84
2.2.2 Carcinôm tuyến vú 85
2.2.3 Bệnh bạch cầu . 87
2.3 Các bước tiến hành 88
2.3.1 Đối với bệnh phẩm carcinôm tuyến ĐTT . 88
2.3.2 Đối với thân nhân bệnh nhân carcinôm tuyến ĐTT . 89
2.3.3 Đối với bạch bệnh cầu . 91
2.4 Các gen và NST được chọn vào nghiên cứu 102
2.5 Các phương pháp/kỹ thuật áp dụng trong nghiên cứu 102
Carcinôm tuyến ĐTT . 102
Carcinôm tuyến vú 103
Bệnh bạch cầu . 103
2.5.1 Kỹ thuật hoá mô miễn dịch . 103
2.5.2 Kỹ thuật lai tại chỗ gắn hùynh quang (FISH) . 108
2.5.3 Quy trình nuôi cấy tế bào để phân tích NST . 116
2.5.4 Kỹ thuật giải trình tự phát hiện đột biến gen 119
2.5.5 Kỹ thuật RT-PCR (Reverse transcriptase – PCR) trong bệnh bạch cầu . 132
2.5.6 Phương pháp gia hệ và tư vấn di truyền . 135
2.6 Phân tích số liệu 137
2.6.1 Carcinôm tuyến đại trực tràng và carcinôm tuyến vú . 137
2.6.2 Bệnh bạch cầu . 138
2.7 Địa điểm nghiên cứu 138
2.8 Vấn đề y đức 139

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 140
NỘI DUNG I: CARCINÔM TUYẾN ĐẠI TRỰC TRÀNG .141
I.3.1 Đặc điểm chung của nhóm nghiên cứu 142
I.3.1.1 Các đặc điểm chung của bệnh nhân 142
I.3.1.2 Các đặc điểm chung của nhóm tầm soát . 143
I.3.2 Đột biến gen p53 trong carcinôm tuyến ĐTT 145
I.3.2.1 Tỉ lệ đột biến gen p53 . 145
I.3.2.2 Vị trí exon bị đột biến . 146
I.3.2.3 Vị trí codon bị đột biến . 147
I.3.2.4 Số lượng đột biến trên một mẫu bệnh phẩm . 149
I.3.2.5 Các kiểu đột biến trình tự gen p53 149
I.3.2.6 Sự biến đổi protein TP53 153
I.3.3. Biểu hiện protein TP53, Ki67 và Her-2/ EGFR trong carcinôm tuyến ĐTT và liên quan với các đặc điểm khác 156
I.3.3.1 Biểu hiện của protein TP53 156
I.3.3.2 Liên quan giữa protein TP53, đột biến gen p53 với các đặc điểm của carcinôm tuyến ĐTT 159
I.3.3.3 Biểu hiện của Ki 67 162
I.3.3.4 Biểu hiện của HER1 (EGFR) . 163
I.3.3.5 Biểu hiện của HER2 . 164
I.3.3.6. Mối liên quan giữa biểu hiện Ki67, EGFR với các đặc điểm của carcinôm tuyến ĐTT 164
I.3.4 Các giá trị của các xét nghiệm phân tích đột biến gen p53, biểu hiện tích tụ quá mức protein TP53, Ki67, EGFR trong theo dõi đáp ứng điều trị và tiên lượng carcinôm tuyến ĐTT 168
I.3.4.1 Thời gian sống không bệnh 168
I.3.4.2 Tái phát và tử vong . 170
I.3.5 Ứng dụng phương pháp gia hệ kết hợp với các kỹ thuật xác định đột biến gen p53, tăng biểu hiện protein TP53 trong việc tầm soát phát hiện sớm các trường hợp carcinôm tuyến ĐTT 173
I.3.5.1 Các triệu chứng phát hiện khi tham gia sàng lọc 174
I.3.5.2. Các bệnh phát hiện khi tham gia sàng lọc . 174
I.3.5.3 Mối liên quan giữa biểu hiện protein TP53 và đột biến gen p53 trên
mẫu bệnh phẩm và tính chất ác tính của thương tổn phát hiện khi sàng lọc . 176

NỘI DUNG II: UNG THƯ VÚ 179
II.3.1 Đặc điểm của mẫu nghiên cứu 180
II.3.2 HER2 182
II.3.2.1 Biểu hiện của thụ thể HER2 . 182
II.3.2.2 Biểu hiện của gen HER2 qua kỹ thuật FISH . 183
II.3.2.3. Tương quan giữa hai phương pháp đánh giá HER2 184
II.3.2.4 Mối liên quan giữa HER2 và vài yếu tố lâm sàng . 187
II.3.2.5 Mối liên quan giữa HER2 và các yếu tố mô bệnh học 188
II.3.3 Khảo sát p53 192
II.3.3.1 Biểu hiện của protein TP53 qua kết quả HMMD 192
II.3.3.2 Biểu hiện của gen p53 193
II.3.3.3 Giải thích về khác biệt hai kết quả trong carcinôm tuyến vú 201
II.3.4 Ki67 207
II.3.5. Liên quan của biểu hiện protein TP53, đột biến gen p53 và Ki67 với các đặc điểm của carcinôm tuyến vú 208
II.3.5.1 Với nhóm tuổi 209
II.3.5.2 Với loại mô học . 209
II.3.5.3 Với độ mô học . 211
II.3.5.4 Với tình trạng hạch 212
II.3.6 Carcinôm tuyến vú có tính gia đình 213
II.3.6.1 Tỉ lệ carcinôm tuyến vú có bệnh sử gia đình . 213
II.3.6.2 Đặc điểm BRCA 1 . 215
II.3.6.3 Đối chiếu đột biến gen BRCA1 với yếu tố gia đình và ung thư . 225

PHẦN III: BỆNH BẠCH CẦU .227
III. 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 228
III. 3.1 Kết quả chung của nhóm nghiên cứu 228
III. 3.2 Nhóm bệnh bạch cầu mạn dòng tủy 229
III.3.2.1 Đặc điểm BN bệnh BCMDT giai đoạn mạn trong nghiên cứu . 229
III. 3.2.2 Kết quả xác định bất thường NST . 231
III. 3.2.3 Kết quả điều trị bệnh BCMDT giai đoạn mạn 233
III. 3.3 Nhóm bệnh bạch cầu cấp dòng tủy (BCCDT) 238
III. 3.3.1 Đặc điểm bệnh nhân BCCDT trong nhóm nghiên cứu . 238
III. 3.3.2 Kết quả điều trị nhóm BCCDT trong nhóm nghiên cứu . 242
III. 3.4 Nhóm bệnh BBCDL 246
III. 3.4.1 Đặc điểm BN BCCDL trong nghiên cứu 246
3.4.2 Kết quả điều trị bạch cầu cấp dòng lymphô 251
III. 3.5 Tính di truyền trong bệnh bạch cầu 257
III. 4. BÀN LUẬN 258
III. 4.1 Nhóm bệnh bạch cầu mạn dòng tủy (BCMDT) 258
III. 4.1.1 Đặc điểm bệnh nhân BCMDT 258
III. 4.1.2 Kết quả huyết đồ trong nhóm nghiên cứu . 260
III. 4.1.3 Về kết quả các kỹ thuật xác định bất thường NST và Gen trong
bệnh BCMDT . 260
III. 4.1.4 Về kết quả điều trị BCMDT giai đoạn mạn 263
III. 4.1.5 Phân tích thời gian sống sau khi điều trị Imatimib Mesylate . 266
III. 4.2 Nhóm bệnh bạch cầu cấp dòng tủy (BCCDT) 267
III. 4.2.1 Đặc điểm dịch tễ và lâm sàng trong nhóm nghiên cứu . 267
III. 4.2.2 Đặc điểm sinh học . 267
III. 4.2.3 Về kết quả các kỹ thuật xác định bất thường NST và gen trong bệnh BCCDT 268
III. 4.2.4 Kết quả điều trị sau tấn công . 270
III. 4.2.5 Phân tích tỷ lệ tái phát sau lui bệnh hoàn toàn: 271
III. 4.2.6 Phân tích thời gian sống sau điều trị . 272
III. 4.3 Nhóm bệnh bạch cầu cấp dòng lymphô (BCCDL) 272
III. 4.3.1 Đặc điểm bệnh nhân BCCDL: 272
III. 4.3.2 Đặc điểm lâm sàng và sinh học . 273
III. 4.3.3 Về kết quả các kỹ thuật xác định bất thường NST và gen trong bệnh
BCCDL 275
III. 4.3.4 Kết quả điều trị 277

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN 282
4 1. Ung thư ĐTT 282
4.1.1 Tỉ lệ và các kiểu đột biến gen p53 trong carcinôm tuyến ĐTT 282
4.1.2 Tỉ lệ biểu hiện quá mức protein TP53, Ki67 và EGFR trong carcinôm tuyến ĐTT và mối liên quan với các đặc điểm giải phẫu bệnh .282
4.1.3. Giá trị của các xét nghiệm đột biến gen p53, biểu hiện tích tụ quá mức protein TP53, EGFR và Ki67 trong theo dõi đáp ứng điều trị và tiên lượng carcinôm tuyến ĐTT 283
4.1.4. Ứng dụng phương pháp gia hệ kết hợp với các kỹ thuật xác định đột biến gen p53, tăng biểu hiện protein TP53 trong việc tầm soát phát hiện sớm các trường hợp carcinôm tuyến ĐTT . 284
4 2. Ung thư vú 284
4.2.1.Đặc điểm về tuổi, bệnh sử gia đình, mô bệnh học theo WHO. 284
4.2.2 Sự biểu hiện gen sinh u HER2 bằng kỹ thuật HMMD và FISH . 285
4.2. 3. Sự biểu hiện của p53 bằng kỹ thuật HMMD và giải trình tự gen . 285
4.2.4. Sự biểu hiện của Ki67 bằng kỹ thuật HMMD . 287
4.2.5. Carcinôm tuyến vú gia đình . 287
4.3 Bệnh bạch cầu 287
4.3.1. Đối với từng nhóm bệnh 287
4.3.2 Hoàn chỉnh và thiết lập các quy trình xét nghiệm sau: . 288

4.4 KẾT LUẬN CHUNG CỦA ĐỀ TÀI 290
4.4.1 Tỉ lệ về các dạng đột biến NST, đột biến gen trong carcinôm vú, carcinôm tuyến ĐTT và bệnh bạch cầu . 290
44.1.2 Carcinôm tuyến ĐTT (gen p53) 291
4.4.1.3 Bệnh bạch cầu 292
4.4.2 Dữ liệu trình tự của gen đột biến và các dạng đột biến NST đặc hiệu trong các ung thư trên 293
4.4.2.3 Bệnh bạch cầu 297
4.4.3 Bảng danh sách đề xuất các dấu ấn khối u (tumor marker) có liên quan
đến các ung thư nêu trên 300
4.4.4 Bản báo cáo về ứng dụng phương pháp phả hệ kết hợp với di truyền
hiện đại trong phân tích và tiên lượng các bệnh ung thư trên 301
5. KIẾN NGHỊ 304
5. 1. Về ung thư ĐTT 304
5.2 Về ung thư vú 304
5.3 Về bệnh bạch cầu 305
6. CÁC ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI 307
6.1 Trong ung thư vú 307
6.2 Trong ung thư đại-trực tràng 308
Trong bệnh bạch cầu 308
TÀI LIỆU THAM KHẢO 310
Tiếng Việt 310
Tiếng Pháp 314
Tiếng Anh 314
ĐẶT VẤN ĐỀ
Ung thư ảnh hưởng đến con người ở tất cả mọi lứa tuổi và nguy cơ ung thư tăng dần theo tuổi. Ung thư là nguyên nhân gây tử vong cho 13% (7,6 triệu) người chết trong năm 2007 [239]. Ung thư là bệnh lý do tác động của môi trường với 90-95% bệnh xảy ra do lối sống và môi trường, 5-10% do di truyền. Tất cả các yếu tố di truyền này có thể gây rối loạn chất liệu di truyền trong tế bào. Ung thư đại trực tràng (ĐTT) và ung thư vú đều có thể điều trị và có tiên lượng tương đối tốt nếu phát hiện bệnh sớm. Tiên lượng và đáp ứng điều trị phụ thuộc rất nhiều yếu tố như giai đoạn bệnh, loại mô học, độ mô học, các đột biến gen (ras, p53) [110], [178]. Mức độ tăng sinh tế bào u cũng là một trong những yếu tố tiên lượng quan trọng. Ki67 là kháng nguyên căn bản để xác định hoạt động của tế bào u. Kháng nguyên Ki67 biểu hiện trong nhân tế bào u ở pha G1, S, G2, và M của chu trình tế bào, trừ pha nghỉ Go. Nhiều nghiên cứu chứng minh Ki67 là một yếu tố tiên lượng độc lập liên quan đến sống còn của bệnh nhân ung thư ĐTT cũng như trong ung thư vú [121], [231]. Bệnh bạch cầu là bệnh lý ác tính của tế bào gốc đa năng đặc trưng bởi sựtăng sinh quá mức tế bào máu làm tích tụ tế bào non trong bạch cầu cấp, hoặc tăng sinh quá mức nhưng có hiện tượng biệt hóa trong bạch cầu mạn, làm suy giảm các dòng tế bào máu bình thường. Bệnh gặp ở mọi lứa tuổi và cả 2 giới, nhưng bạch cầu cấp dòng tủy (BCCDT) và bạch cầu mạn dòng tủy (BCMDT) thường gặp ở người lớn, ngược lại bạch cầu cấp dòng lymphô (BCCDL) thường gặp ở trẻ em, và đó là 3 thể bệnh thường gặp nhất trong nhóm bệnh lý máu ác tính. Những bất thường nhiễm sắc thể (NST) và các bất thường về gen đặc trưng cho các dạng ung thư máu, có ý nghĩa tiên lượng độc lập, giúp lựa chọn phác đồ điều trị thích hợp và là một dấu ấn để theo dõi điều trị.
Hiện nay việc chẩn đoán thường quy các bệnh ung thư chủ yếu dựa vào thăm khám lâm sàng, chẩn đoán hình ảnh, xét nghiệm giải phẫu bệnh. Mặc dù các kỹ thuật này đảm bảo độ chính xác khá cao, giúp chỉ định điều trị phù hợp, nhưng vẫn còn một số hạn chế như sau: (1) Không thể thực hiện ở giai đoạn sớm, khi các khối u chưa có biểu hiện lâm sàng rõ rệt. (2) Không thể phát hiện các đột biến gen, đột biến NST, do đó không cho phép xác định bản chất di truyền của ung thư. (3). Chính vì thế không thể theo dõi, đánh giá hiệu quả điều trị một cách xác thực.
Ở Việt Nam gần đây tại một số khoa/ bệnh viện chuyên khoa ung thư đã bắt đầu ứng dụng một số kỹ thuật chẩn đoán mới, như chẩn đoán bằng hóa mô miễn dịch (HMMD), dấu ấn khối u, xét nghiệm NST đồ, ứng dụng kỹ thuật lai tại chỗ gắn huỳnh quang (FISH). Tuy vậy kết quả chưa ổn định, chưa thể thực hiện thường quy.
Việc ứng dụng các kỹ thuật di truyền tế bào và di truyền phân tử (phân tích DNA, phân tích biểu hiện gen p53 ) giúp giải quyết các nhiệm vụ sau
đây:
- Chuẩn hóa và ứng dụng các kỹ thuật di truyền hiện đại trong chẩn đoán và tiên lượng bệnh ung thư.
- Xem xét khả năng ứng dụng kỹ thuật tầm soát / sàng lọc các trường hợp có nguy cơ bị ung thư.
- Xây dựng êkip các nhà di truyền học ung thư để phát triển nghiên cứu và ứng dụng các kỹ thuật di truyền vào chẩn đoán, phát hiện sớm và điều trị ung thư.
- Ứng dụng phương pháp gia hệ trong nghiên cứu phát hiện các trường hợp có hội chứng tiền định ung thư di truyền, thực hiện tư vấn, theo dõi, tầm soát phát hiện các trường hợp có nguy cơ bị ung thư.
Đề tài “Nghiên cứu ứng dụng các kỹ thuật di truyền hiện đại trong chẩn đoán và tiên lượng một số bệnh ung thư thường gặp ở Việt Nam” thuộc “Chương trình Khoa học và Công nghệ trọng điểm cấp Nhà nước” giai đoạn 2006-2010, mang mã số KC.10.18/06-10, được phê duyệt và có thời gian thực hiện từ tháng 3 năm 2008 đến tháng 08 năm 2010.
Mục tiêu
Hai mục tiêu tổng quát của đề tài là:
(1) Xác định và chuẩn hóa được các kỹ thuật di truyền học hiện đại trong phân tích các rối loạn vật chất di truyền trong một số bệnh ung thư.
(2) Ứng dụng các kỹ thuật trên trong chẩn đoán và tiên lượng một số bệnh ung thư.