Tài liệu Nghiên cứu tối ưu hóa quy trình tách và dung hợp protoplast giữa các dòng khoai tây dại với giống kh

ĐỀ TÀI: Nghiên cứu tối ưu hóa quy trình tách và dung hợp protoplast giữa các dòng khoai tây dại với giống khoai tây trồng Atlantic phục vụ chương trình chọn tạo giống khoai tây kháng bệnh virus và bệnh mốc sương

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
------› ¶ š------



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đề tài
NGHIÊN CỨU TỐI ƯU HểA QUY TR̀NH TÁCH VÀ DUNG HỢP PROTOPLAST GIỮA CÁC DềNG KHOAI TÂY DẠI VỚI GIỐNG KHOAI TÂY TRỒNG ATLANTIC PHỤC VỤ CHƯƠNG TR̀NH CHỌN TẠO GIỐNG KHOAI TÂY KHÁNG BỆNH VIRUS VÀ
BỆNH MỐC SƯƠNG


Giáo viên hướng dẫn : GS.TS. Nguyễn Quang Thạch
KS. Hoàng Thị Giang
Sinh viên thực hiện : Phạm Thị Ngân
Lớp : KSCNSH0702 – K14


HÀ NỘI - 2011


LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá tŕnh thực tập cuối khoá tại Pḥng thí nghiệm Công nghệ sinh học khoai tây - Viện sinh học nông nghiệp - Trường đại học nông nghiệp Hà Nội, tôi đă nhận đước giúp đỡ nhiệt t́nh, chu đáo của thầy giáo, GS.TS Nguyễn Quang Thạch. Thầy đó giỳp tụi nâng cao kiến thức, hiểu biết sâu và rộng hơn về công nghệ sinh học trong nông nghiệp nói riêng và lính vực khác của công nghệ sinh học nói chung. Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ ḷng biết ơn sâu sắc và kính trọng tới thầy.
Tôi xin gửi lời biết ơn chân thành tới các cán bộ công tác tại Viện sinh học nông nghiệp, đặc biệt là KS. Hoàng Thị Giang đă chỉ bảo và tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt thời gian thực tập tại đây.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô giáo Viện đại học Mở Hà Nội, đặc biệt là các thầy cô khoa Công nghệ sinh học đă truyền đạt những kiến thức vô cùng quư báu cho tụi cú nền tảng cơ sở để tôi có thể hoàn thành tốt luận văn này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới gia đ́nh, bạn bè tôi, những người luôn chia sẻ, động viên, giúp đỡ và góp ư cho tôi trong suốt quá tŕnh thực tập và hoàn thành bào cáo tốt nghiệp.

Hà nội, ngày 25 tháng 5 năm 2011
Sinh viên


Phạm Thị Ngân

MỤC LỤC


MỞ ĐẦU
I. Đặt vấn đề
II. . Mục đích và yêu cầu
1. . Mục đích
2. . Yêu cầu
PHẦN I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.Giới thiệu chung về khoai tây
1.1.1 Nguồn gốc
1.1.2 Phân loại
1.1.3 Đặc điểm thực vật học của cây khoai tây
1.1.4 T́nh h́nh sản xuất khoai tây trên thế giới và trong nước
1.2. T́nh h́nh nhiễm bệnh virus ở khoai tây
1.2.1 T́nh h́nh nhiễm bệnh vius
1.2.2 Tác hại của bệnh virus
1.2.3. T́nh h́nh nhiễm bệnh mốc sương ở khoai tây
1.3. Các hướng nghiên cứu tạo giống khoai tây
1.3.1. Nghiên cứu chuyển gen
1.3.2 Nghiên cứu dung hợp tế bào trần
1.3. Tạo giống khoai tây bằng dung hợp tế bào trần
1.3.1 Khái niệm tế bào trần (protoplast) và con lai soma (somatic hybrid)
1.3.2 Quá tŕnh tách, dung hợp, nuôi cấy và tái sinh protoplast
1.3.3 Xác định con lai soma
PHẦN II. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
2.1.1 Giống khoai tây Atlantic (Solanum .tuberosum cv.Atlantic)
2.1.2 Các ḍng khoai tây dại
2.2. Nội dung, địa điểm và thời gian nghiên cứu
2.2.1 Nội dung nghiên cứu
2.2.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp tách protoplast (Theo quy tŕnh của viện JKI – viện
2.3.2 Phương pháp đếm protoplast và pha loăng mật độ
2.3.3 Phương pháp chuẩn bị hóa chất tách protoplast
2.3.5 Phương pháp dung hợp protoplast bằng xung điện
2.3.6 Phương pháp chuẩn bị dung dịch dung hợp.
2.3.7 Phương pháp nuôi cấy và tái sinh protoplast sau khi dung hợp
2.3.8 Các chỉ tiêu theo dơi
2.3.9 Phuơng pháp xử lư số liệu:
PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Các kết quả tách protoplast
3.1.1 Thí nghiệm 1: So sánh khả năng tách protoplast của các kiểu gen khác nhau
3.1.2 Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của tuổi lá cây in vitro đến năng suất và chất lượng tách protoplast của các ḍng khoai tây dại và giống Atlantic
3.1.3 Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ dung dịch Enzyme đến năng suất và chất lượng của protoplast
3.2. Các kết quả nuôi cấy protoplast
3.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nền môi trường nuôi cấy đến sự phân chia và tái sinh của protoplast
3.2.2 So sánh ảnh hưởng của loại môi trường nuôi cấy đến sự phân chia và tái sinh của protoplast
3.3. Các kết quả dung hợp protoplast
3.3.1 Tối ưu hóa các thông số của quy tŕnh dung hợp bằng xung điện giữa giống khoai tây Atlantic và ḍng khoai tây dại
PHẦN IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
4.1. Kết luận
4.2. Đề nghị
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1: Diện tích, năng suất và sản lượng khoai tây các khu vực trên thế giới năm 2007
Bảng 2: Diện tích, năng suất và sản lượng khoai tây ở Việt Nam
Bảng 3: Khả năng tách protoplast của các vật liệu nghiên cứu
Bảng 4: Ảnh hưởng của tuổi lá cây in vitro đến năng suất và chất lượng protoplast
Bảng 5: Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch enzym đến năng suất và chất lượng protoplast
Bảng 6: Ảnh hưởng của nền môi trường nuôi cấy đến sự phân chia protoplast và h́nh thành microcalli
Bảng 7: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phân chia protoplast và h́nh thành microcalli














DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ


Biểu đồ 1: Ảnh hưởng của tuổi lá cây in vitro đến năng suất protoplast
Biểu đồ 2: : Ảnh hưởng của nền môi trường nuôi cấy đến sự phân chia protoplast
Biểu đồ 3: Ảnh hưởng của loại môi trường nuôi cấy đến sự phân chia và h́nh thành microcalli của protoplast


DANH MỤC CÁC HèNH


H́nh 1: H́nh ảnh lớp nổi protoplast sau khi li tâm lần 1
H́nh 2: protoplast của các ḍng sau khi tách
H́nh 3: Mật protoplast của giống Atlantic tách bằng các dung dịch enzym khác nhau
H́nh 4: H́nh ảnh microcallus trên các nền môi trường khác nhau của giống Atlantic
H́nh 5: H́nh ảnh callus của giống Atlantic phân chia trên các nền môi trường
H́nh 6: H́nh ảnh protoplast của giống Atlantic phân chia trên môi trường VKM II
H́nh 7: Protoplast sau khi xung điện












CÁC KÍ TỰ VIẾT TẮT

· AFLP-Amplified Fragment length polymorphism
· BC (Back cross)
· NST. Nhiễm sắc thể
· PLRV. Potato leafroll luteovirus PLRV
· PVA .Potato A potyvirus
· PVM. Potato M carlavirus
· PVM. Potato M carlavirus
· PVS. Potato S carlavirus
· PVV. Potato V potyvirus
· PVX .Potato X potexvirus
· PVY.Potato Y potyvirus








MỞ ĐẦU
I. Đặt vấn đề
Khoai tây là một loại cây trồng quan trọng của Việt Nam, đặc biệt là đối với vùng Đồng bằng Sông Hồng. Gần đây, do sự biến đổi của khí hậu toàn cầu đă làm thay đổi sản xuất cây trồng trên thế giới cũng như ở Việt Nam. Sự biến đổi của khí hậu kéo theo sự xuất hiện của hàng loạt các loại bệnh và dịch hại làm thiệt hại đến năng suất và sản lượng cây trồng nghiêm trọng. Để đối phó với những tác động của sự biến đổi khí hậu toàn cầu trong tương lai, nhiệm vụ cấp thiết đặt ra cho các nhà chọn tạo giống khoai tây là phải tạo ra các giống mới không chỉ có năng suất cao, chất lượng tốt mà đồng thời phải chống chịu được với các stress môi trường.
Hiện nay, sản xuất khoai tây trên thế giới nói chung và của Việt Nam nói riêng đang phải đối mặt với 2 loại bệnh virus, trong đó PVY là bệnh nguy hiểm hơn cả và bệnh mốc sương (do nấm Phytophthora infestans). Chiến lược sử dụng các loại thuốc bảo vệ thực vật để pḥng trừ bệnh virus PVY đă không thành công (Jones và cộng sự, 1982; De Bokx và Van der Want, 1987; Valkolen và cộng sự, 1996). Việc trồng các củ giống vị nhiễm virus PVY (potato Ypotyvirus) hoặc PLRV (potato leafroll luteovirus) đă làm giảm năng suất tới 80% (Banttari và cộng sự, 1993). Bên cạnh đó, bệnh mốc sương cũng được cho là một bệnh hại khoai tây nghiêm trọng nhất hiện nay trên toàn thế giới (Hammann, 2009; Thieme, 2010). Để pḥng trừ bệnh này đă phải mất lượng lớn thuốc bảo vệ thực vật mỗi năm (mất khoảng 14 lần phun/mỗi vụ). Mỗi năm nước Đức đă phải chi tới 470 EURO/ha để pḥng trừ bệnh này bằng thuốc bảo vệ thực vật (Darsow, 2008).
Cỏc ḍng khoai tây dại có khả năng kháng cao với hầu hết các chủng gây bệnh virus và mốc sương. Do đó, các loài khoai tây dại này như một nguồn cung cấp gen giàu có cho quá tŕnh cải tiến giống khoai tây của các nhà chọn tạo giống và các nhà di truyền học. Tuy nhiên rất khó để lai tạo hữu tính giữa các loài dại (2n = 2x = 24) với khoai tây trồng (2n = 4x = 48) do sự không tương hợp về genom, sự bất thụ trong lai xa Chính v́ thế lai soma bằng dung hợp protoplast là một giải pháp rất hữu hiệu để khắc phục những nhược điểm trên