Thạc Sĩ Nghiên cứu tính đối kháng của Aspergillus flavus không sinh độc tố để phòng chống aflatoxin trên ngô

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn Bộ Giáo dục và Đào tạo, Trường Đại học Bách khoa
Hà Nội, Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch đã giúp đỡ tạo điều
kiện cho tôi trong quá trình học tập cũng như hoàn thành luận án của mình.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến GS.TS. Nguyễn Thuỳ Châu - Nguyên
trưởng Bộ môn Nghiên cứu Công nghệ Sinh học sau thu hoạch, Viện Cơ điện Nông
nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch và PGS.TS. Nguyễn Thị Xuân Sâm – Trưởng bộ
môn Vi sinh - Hóa sinh - Sinh học phân tử, Viện Công nghệ Sinh học & CNTP, trường
Đại học Bách Khoa Hà Nội là những người thầy đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều
kiện thuận lợi, giúp đỡ và chia sẻ những khó khăn cùng tôi trong suốt thời gian tôi
thực hiện luận án này.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến PGS.TS. Đinh Duy Kháng - Trưởng phòng
Vi sinh vật học phân tử, đã tạo điều kiện thuận lợi và ủng hộ tôi trong quá trình thực
hiện luận án.
Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ phụ trách đào tạo, Viện đào tạo sau đại
học - Trường Đại học Bách khoa Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi hoàn
thành mọi thủ tục cần thiết trong quá trình làm nghiên cứu sinh.
Trong thời gian qua, tôi đã nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình của các anh chị và
các bạn đồng nghiệp ở Bộ môn Nghiên cứu Công nghệ Sinh học sau thu hoạch - Viện
Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch, Phòng Vi sinh vật phân tử - Viện
Công nghệ sinh học và Bộ môn Vi sinh, Hóa sinh, Sinh học phân tử - Trường Đại học
Bách khoa Hà Nội. Nhân dịp này tôi cũng xin chân thành cảm ơn những sự giúp đỡ
quý báu đó.
Tôi rất biết ơn những người thân trong gia đình đã quan tâm và tạo điều kiện tốt
nhất cho tôi học tập và nghiên cứu. Tôi cũng vô cùng cảm ơn sự động viên, khích lệ
của bạn bè trong và ngoài Viện đã dành cho tôi.
Hà Nội, ngày 23 tháng 6 năm 2014





Lê Thiên Minh ii
LỜI CAM ĐOAN



Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng
tôi. Các số liệu và kết quả nêu trong luận án là trung thực
và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào
khác.

Hà nội, ngày 23 tháng 6 năm 2014

Tác giả






Lê Thiên Minh












iii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADN Axit deoxyribonucleic
ARN Axit ribonucleic
EDTA Axit etylen diamin tetra axetic
SDS-PAGE Điện di trên gel polyacrylamit có chứa sodium dodecyl sulfate
TCA Axit trichloroaxetic
v/p vòng / phút
v/v Thể tích/thể tích
vvm thể tích/thể tích/phút
w/v Trọng lượng /thể tích
X Axit amin bất kỳ
WHO Tổ chức Y tế thế giới
Tm Nhiệt độ tan chảy
FDA Cục quản lý Thực phNm và Dược phNm Hoa kỳ
TE Tris EDTA
PCR Polymerase chain reaction
SDS Sodium dodecyl sulfate
TLC Thin layer chromatography (sắc ký lớp mỏng)
EtBr Ethydium bromit
dNTP Deoxiribonucleotit triphosphat
A. flavus Aspergillus flavus
A. parasiticus Aspergillus parasiticus
NOR Norsolorinic acid
AVN Averantin
HAVN 5’
hydroxyaverantin
OAVN Oxoaverantin
AVNN Averufanin
AVF Averufin
VHA Versiconal hemiacetal acetate
VAL Versiconal
VERB Versicolorin B
VERA Versicolorin A
DMST Demethylsterigmatocystin
DHDMST Dihydro demethylsterigmatocystin
ST Sterigmatocystin
DHST Dihydro sterigmatocystin
OMST O-methylsterigmatocystin
DHOMST Dihydro-O-methylsterigmatocystin
AFB1 Aflatoxin B1
AFB2 Aflatoxin B2
AFG1 Aflatoxin G1
AFG2 Aflatoxin G2 iv
Danh môc c¸c b¶ng
STT Tên bảng Trang
1 Bảng 1.1 Một số tính chất lý, hóa của các aflatoxin 8
2 Bảng 1.2 Giới hạn aflatoxin cho phép trên nông sản thực ph
m 12
3 Bảng 1.3 Giới hạn aflatoxin trong thức ăn tinh hỗn hợp cho Bê và Bò 12
4 Bảng 1.4 Giới hạn aflatoxin trong thức ăn chăn nuôi 13
5 Bảng 1.5 Đặc điểm hình thái của A. flavus 14
6 Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm thử độc tính cấp mẫu A. flavus DA2 40
7 Bảng 3.1 Kết quả phân lập các chủng A. flavus từ ngô, lạc ở một số tỉnh Việt
Nam
44
8 Bảng 3.2 Khả năng tạo aflatoxin của các chủng A. flavus phân lập từ ngô và
lạc
45
9 Bảng 3.3a Đặc điểm hình thái của các chủng A. flavus phân lập từ các mẫu ngô
và lạc
47
10 Bảng 3.3b Đặc điểm hình thái của các chủng A. flavus phân lập từ các mẫu
ngô và lạc
48
11 Bảng 3.4a Đặc điểm cấu trúc vi học của các chủng A. flavus phân lập từ các
mẫu ngô và lạc
49
12 Bảng 3.4b Đặc điểm cấu trúc vi học của các chủng A. flavus phân lập từ các
mẫu ngô và lạc
50
13 Bảng 3.5 Khả năng sinh aflatoxin B1 của chủng A. flavus phân lập 52
14 Bảng 3.6 Hiệu quả giảm aflatoxin B1 của chủng A. flavus AF14 nuôi cấy trên
môi trường ngô bằng các chủng A. flavus không sinh aflatoxin
54
15 Bảng 3.7 Mật độ tế bào A. flavus DA2 và A. flavus AF14 khi nuôi hỗn hợp theo
tỉ lệ 1:1
55
16 Bảng 3.8 Trình tự các cặp mồi 58
17 Bảng 3.9 Tổng hợp kết quả PCR với các mồi đã sử dụng 60
18 Bảng 3.10 Ảnh hưởng của A. flavus DA2 đến trọng lượng cơ thể chuột 63
19 Bảng 3.11 Mật độ bào tử của chủng A. flavus DA2 tạo được trên các môi
trường khác nhau
66 v
20 Bảng 3.12 Khả năng tạo bào tử chủng A. flavus DA2 của nhiệt độ nuôi cấy
khác nhau
67
21 Bảng 3.13 Ảnh hưởng của độ
m môi trường đến khả năng tạo bào tử của
chủng A. flavus DA2
68
22 Bảng 3.14 Thời điểm thu bào tử của chủng A. flavus DA2 69
23 Bảng 3.15 Ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống tới mật độ bào tử A. flavus DA2 70
24 Bảng 3.16 Ảnh hưởng của độ dày khối ủ tới mật độ bào tử chủng A. flavus
DA2
71
25 Bảng 3.17 Mật độ bào tử A. flavus DA2 trong các chất mang ở các thời gian
bảo quản khác nhau
72
26 Bảng 3.18 Khả năng cạnh của chế ph
m A.flavus DA2 ở các tỷ lệ khác nhau
bằng sắc ký TLC
76
27 Bảng 3.19 Khả năng cạnh tranh của chủng A.flavus DA2 khi bón vào đất ở các
tỷ lệ khác nhau
77
28 Bảng 3.20. Ảnh hưởng của các thuốc bảo vệ thực vật hóa học đến sự phát triển
sinh khối của A.flavus DA2
80
29 Bảng 3.21 Mức độ nhiễm nấm mốc A.flavus trên đất trồng ngô, lạc tại một số
tỉnh Việt Nam
82
30 Bảng 3.22 Khả năng cạnh tranh của chủng A.flavus DA2 không sinh aflatoxin
trong đất trồng ngô sử dụng chế ph
m AF
84
31 Bảng 3.23 Hiệu quả giảm nấm mốc và aflatoxin của chủng A.flavus DA2 trên
ngô bắp ở giai đoạn trước thu hoạch
86
32 Bảng 3.24 Hiệu quả phòng chống nấm mốc và aflatoxin của chế ph
m AF trên
ngô sau thời gian bảo quản 6 tháng
89
33 Bảng 3.25 Khả năng cạnh tranh của chủng A.flavus DA2 không sinh aflatoxin
trong đất trồng lạc được bón chế ph
m AF
91
34 Bảng 3.26 Hiệu quả giảm nấm mốc và aflatoxin của chủng A.flavus DA2 trên
lạc củ ở giai đoạn trước thu hoạch
92
35 Bảng 3.27 Hiệu quả giảm nấm mốc và aflatoxin của chủng A.flavus DA2 trên
lạc sau thời gian bảo quản 6 tháng
93 vi
Danh môc c¸c h×nh

STT Tên hình Trang
1 Hình 1.1 Công thức cấu tạo của một số dạng aflatoxin 6
2 Hình 1.2 Aflatoxin tương tác đồng hóa trị với vật chất di truyền 9
3 Hình 1.3 Khu
n lạc A.flavus 15
4 Hình 1.4 Hệ sợi A.flavus quan sát dưới kính hiển vi 15
5 Hình 1.5 Cơ chế sinh tổng hợp aflatoxin 17
6 Hình 1.6 Hàm lượng aflatoxin trên hạt bông giảm khi tỷ lệ AF36 tăng 29
7 Hình 3.1 Sắc ký đồ phân tích aflatoxin tạo bởi chủng A. flavus AF14 52
8 Hình 3.2 Sắc ký đồ thể hiện khả năng sinh aflatoxin B1 của chủng A. flavus
DA2
53
9 Hình 3.3 Kiểm tra hàm lượng aflatoxin B1 của hỗn hợp các chủng A.flavus
nuôi cấy trên cơ chất ngô bằng sắc ký bản mỏng (TLC)
54
10 Hình 3.4 Chủng A. flavus DA2 cạnh tranh và lấn át chủng A. flavus AF14
trên đĩa thạch
56
11 Hình 3.5 Chất lượng ADN tổng số trên gen agarose 1,5% 59
12 Hình 3.6 Sản ph
m multiplex PCR của chủng A.flavus DA2 và A. flavus
AF14
59
13 Hình 3.7 Khả năng sinh aflatoxin của chủng A.flavus DA2 sau 5, 10 và 15
thế hệ
61
14 Hình 3.8 Sự tồn tại của các gen aflR, ver, omt và nor của chủng A.flavus
DA2 sau 5, 10 và 15 thế hệ
61
15 Hình 3.9 Đường cong sinh trưởng của chủng A.flavus DA2 65
16 Hình 3.10 Khả năng cạnh tranh của A.flavus DA2 ở các tỷ lệ khác nhau 75
17 Hình 3.11 Khả năng đối kháng của chế ph
m A.flavus DA2 ở các thời điểm
cấy khác nhau
78
18 Hình 3.12 Khả năng đối kháng của chủng A.flavus DA2 khi có mặt của
thuốc bảo vệ thực vật
81 vii
19 Hình 3.13 Nấm mốc nhiễm trên đất trồng ngô 83
20 Hình 3.14 Khu
n lạc chủng A.flavus phát quang phân lập từ đất trồng ngô
được bón chế ph
m AF tại xã Tam Hồng, Yên Lạc, Vĩnh Phúc (8/2007-
6/2008)
85
21 Hình 3.15 Khả năng kiểm soát aflatoxin trên ngô trước thu hoạch của chế
ph
m AF
87
22 Hình 3.16 Bắp ngô ở ruộng sử dụng hai lần chế ph
m AF 88
23 Hình 3.17 Bắp ngô ở ruộng không sử dụng chế ph
m AF 88
24 Hình 3.18 Ngô sử dụng và không sử dụng chế ph
m AF sau thời gian bảo
quản 6 tháng
90
25 Hình 3.19 Chủng A. flavus phát quang và không phát quang phân lập trên
đất trồng lạc
92
26 Hình 3.20 Lạc sử dụng và không sử dụng chế ph
m AF sau thời gian bảo
quản 6 tháng
94






1
0ӨC LӨC
Trang
LӠI &ҦM ѪN . i
LӠI CAM ĈOAN. . ii
DANH MӨC CÁC KÝ HIӊU VÀ CHӲ VIӂT TҲT .iii
DANH MӨC CÁC BҦNG. iv
DANH MӨC CÁC HÌNH ҦNH, ĈӖ THӎ vi
MӢĈҪU . .4
CHѬѪNG I. TӘNG QUAN TÀI LIӊU 6
1.1 TӘNG QUAN Vӄ AFLATOXIN . 6
1.1.1 Cҩu tҥo 6
1.1.2 Tính chҩt hóa lý 7
1.1.3 Ĉӝc tính cӫa aflatoxin 8
1.1.4 Thӵc trҥng nhiӉm aflatoxin trên ngô, lҥc . 9
1.1.5 Giӟi hҥn aflatoxin cho phép trong nông sҧn thӵc phҭm 11
1.2 ASPERGILLUS FLAVUS . 13
1.2.1 Ĉһc ÿLӇm hình thái . 13
1.2.2 Các yӃu tӕҧnh hѭӣng ÿӃn sӵ sinh trѭӣng cӫa A. flavus 15
1.2.3 ĈLӅu kiӋn sinh aflatoxin . 16
1.3 PHÒNG CHӔNG SӴ NHIӈM AFLATOXIN . 19
1.3.1 BiӋn pháp canh tác nông nghiӋp 19
1.3.2 BiӋn pháp sau thu hoҥch . 20
1.3.3 BiӋn pháp sinh hӑc 21
1.4 PHÒNG CHӔNG AFLATOXIN BҴNG CHӪNG A.FLAVUS KHÔNG SINH
AFLATOXIN . 22
1.4.1 Cѫ chӃ kiӇm soát nҩm mӕc và aflatoxin bҵng các chӫng A.flavus không sinh
aflatoxin . 22
1.4.2 TuyӇn chӑn các chӫng A. flavus không sinh aflatoxin làm tác nhân ÿӕi kháng
. 24
1.5 NGHIÊN CӬU ӬNG DӨNG CHӂ PHҬM NҨM A. FLAVUS KHÔNG SINH ĈӜC TӔ
TRONG PHÒNG CHӔNG AFLATOXIN . 26