Thạc Sĩ Nghiên cứu tính đa dạng của virus y trên khoai tây trồng tại thái nguyên

MỞ ĐẦU

1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Khoai tây (Solanum tuberosum L.) là một cây lương thực chủ lực đứng đầu trong các loại cây lấy củ trên thế giới và đứng thứ 5 trong số các cây lương thực nói chung (chỉ sau lúa mì, gạo, ngô, đậu tương). Củ khoai tây có giá trị dinh dưỡng cao, được chế biến thành hàng trăm món ăn đặc sắc, ngon miệng và có lợi cho sức khoẻ con người. Củ khoai tây còn là nguyên liệu quan trọng trong ngành công nghiệp, chế biến thức ăn cho gia súc. Ngoài ra, khoai tây còn là một dược phẩm dùng để chữa trị nhiều bệnh như khó tiêu, đau bụng, viêm loét dạ dày, say nắng Với những lợi ích to lớn đó, khoai tây đã được trồng ở hơn 130 quốc gia và là một nguồn thu lớn cho hàng triệu nông dân [5].
Ở khoai tây, bệnh virus đã trở thành một hiểm họa. Người ta thấy có ít nhất 38 loại virus trên khoai tây đã được phát hiện và mô tả, phổ biến là: PVY (potato virus Y), PLRV (potato leafroll virus), PVX (potato virus X), PVA (potato virus A), PVS (potato virus S) Trong đó, PVY gần đây được xem là virus gây bệnh nghiêm trọng nhất (Kerlan, 2008) [40]. Chúng làm giảm kích thước, số lượng cũng như chất lượng củ khoai tây, gây thiệt hại kinh tế tới
80% thậm chí còn hơn (Kerlan và cs, 2008) [41].
Mặc dù vậy, nhận thức của nông dân cũng như những nghiên cứu về bệnh virus trên khoai tây ở nước ta còn rất hạn chế so với các nước Bắc Mĩ và Châu Âu. Do đó, việc chẩn đoán nhanh, chính xác nhằm đưa ra những biện pháp phòng trừ bệnh thích hợp để hạn chế tối đa những thiệt hại do bệnh virus gây ra là hết sức cần thiết. Hơn nữa, những biện pháp truyền thống sử dụng để ngăn cản sự lan truyền của PVY chỉ mang tính chất phòng trừ chứ không thể chống lại được bệnh này, lại tốn nhiều thời gian và công sức.
Gần đây, với việc áp dụng những kĩ thuật tiên tiến của sinh học phân tử vào nghiên cứu chọn tạo giống cây trồng, đặc biệt là sử dụng các vật liệu di truyền từ các virus gây bệnh để tạo cây trồng chuyển gen kháng virus đã thu được kết quả đáng khích lệ như cây khoai tây chuyển gen Nib kháng PVY.
Tạo cây khoai tây chuyển gen kháng virus được coi là một biện pháp hữu hiệu để ngăn chặn và hạn chế tác hại do virus gây ra. Nhưng vấn đề đặt ra là phổ kháng bệnh của những cây chuyển gen này phụ thuộc vào độ tương đồng về mặt di truyền của chủng virus có gen được sử dụng để tạo cây chuyển gen và các dòng virus gây bệnh trong tự nhiên. Vì vậy khảo sát tính đa dạng di truyền của gen mã hoá cho protein vỏ virus (coat protein- CP) có ý nghĩa rất quan trọng trong việc nghiên cứu tạo cây chuyển gen kháng virus.
Xuất phát từ những lí do trên, tôi lựa chọn đề tài cho luận văn thạc sĩ là: “Nghiên cứu tính đa dạng của virus Y trên khoai tây trồng tại Thái Nguyên”.
2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Xác định sự đa dạng trong cấu trúc gen mã hoá protein vỏ (CP- coat protein) của PVY phân lập từ các mẫu lá khoai tây thu tại một số địa phương thuộc tỉnh Thái Nguyên.
3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
3.1. Khảo sát, thống kê và xác định tỉ lệ nhiễm PVY trên khoai tây ở Thái Bình, Thái Nguyên, Hưng Yên, Bắc Giang làm cơ sở cho việc thu mẫu và xác định sự có mặt của virus PVY.
3.2. Tách chiết RNA của virus từ các mẫu khoai tây thu thập được.
3.3. Nhân gen CP, tách dòng và đọc trình tự gen CP của PVY trong các mẫu
khoai tây.
3.4. So sánh trình gen CP của PVY phân lập được với một số trình tự đã công bố trong ngân hàng gen NCBI. .
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Cây khoai tây 3
1.1.1. Nguồn gốc, phân loại và giá trị của khoai tây 3
1.1.2. Một số đặc điểm sinh học của cây khoai tây 5
1.1.3. Tình hình sản xuất khoai tây trên thế giới và ở Việt Nam 5
1.2. Virus gây bệnh trên khoai tây 6
1.2.1. Các loại virus khoai tây 7
1.2.2. Đặc điểm chính của bệnh virus trên khoai tây 9
1.3. Virus Y ở khoai tây 14
1.3.1. Phân loại 14
1.3.2. Cây chủ 14
1.3.3. Hình dạng và cấu trúc phân tử 16
1.3.4. Quan hệ họ hàng với các potyvirus khác 17
1.3.5. Lan truyền của PVY 18
1.3.6. Một số đặc điểm của PVY trên khoai tây 20
1.4. Tình hình nghiên cứu PVY trên thế giới và ở Việt Nam 24
1.4.1. Tình hình nghiên cứu PVY trên thế giới 24
1.4.2. Tình hình nghiên cứu PVY ở Việt Nam 27
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28
2.1. Vật liệu nghiên cứu 28
2.2. Hóa chất, thiết bị, địa điểm nghiên cứu 28
2.2.1. Hóa chất 28
2.2.2. Thiết bị 28
2.2.3. Địa điểm nghiên cứu 29
2.3. Phương pháp nghiên cứu 29
2.3.1. Phương pháp thống kê 29
2.3.2. Phương pháp tách chiết RNA tổng số 30
2.3.3. Phương pháp RT-PCR 31
2.3.4. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR 33
2.3.5. Phương pháp gắn gen vào vector tách dòng 33
2.3.6. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α 34
2.3.7. Phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR) 34
2.3.8. Tách chiết plasmid 34
2.3.9. Phương pháp xác định trình tự nucleotide 35
2.3.10. Phương pháp xử lí trình tự gen thu được 36
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38
3.1. Kết quả khảo sát tỉ lệ nhiễm PVY 38
3.2. Kết quả nhân gen, tách dòng cDNA 40
3.2.1. Kết quả nhân gen bằng kỹ thuật RT-PCR 40
3.2.2. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR 42
3.2.3. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α 43
3.2.4. Kết quả chọn lọc plasmid tái tổ hợp bằng colony-PCR 44
3.2.5. Kết quả tách plasmid từ các khuẩn lạc của 2 mẫu nghiên cứu 46
3.3. Kết quả so sánh trình tự gen CP-PVY phân lập từ 2 mẫu nghiên cứu với một số trình tự trong ngân hàng gen 47
3.3.1. So sánh trình tự nucleotide và acid amine của gen CP-PVY trên 2 mẫu nghiên cứu 47
3.3.2. So sánh trình tự nucleotide gen CP-PVY trên 2 mẫu nghiên cứu với các trình tự gen CP-PVY trên khoai tây đã được công bố trong ngân hàng gen 50
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 55
CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 56
TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 .