Thạc Sĩ Nghiên cứu thu nhận và tinh sạch phytase tái tổ hợp từ nấm men pichia pastoris gs115

MỞ ĐẦU

Photpho là nguyên tố quan trọng trong cơ thể sống. Nó là một chất dinh dưỡng thiết yếu trong nhiều chu trình trao đổi chất. Photpho cùng với canxi cấu tạo nên xương, răng, cùng với protein, lipid và glucid để tham gia cấu tạo tế bào đặc biệt là màng tế bào. Photpho vô cơ ở dạng photphat (PO4)3-, đóng một vai trò quan trọng trong các phân tử sinh học như ADN, ARN, trong đó nó tạo thành một phần trong cấu trúc của các phân tử này. Các tế bào sống cũng sử dụng photphat để vận chuyển năng lượng tế bào thông qua adenosine triphosphat (ATP). ATP còn là yếu tố quan trọng trong sự photphat hóa, một dạng điều chỉnh quan trọng trong các tế bào. Photpho cũng là một nhân tố khoáng chính cần cho gia súc, gia cầm. Nó tham gia trong các photpholipid, là thành phần được các động vật dùng để làm cứng xương của chúng.
Khoảng 50 – 80% tổng lượng photpho tự nhiên hiện diện trong thực vật, là nguyên liệu chế biến thức ăn gia súc, gia cầm. Nó ở dạng liên kết với các chất khoáng, protein hình thành phức hợp không hòa tan. Khoảng 2/3 lượng photpho tổng nằm trong các loại ngủ cốc, cây họ đậu, và hạt cây có dầu hiện diện như là photphophytat và chỉ 1/3 lượng photphophytate được hấp thu và cân bằng được bài tiết.
Nitơ và photpho được xem là có khả năng gây hại đến chất lượng đất và nước. Lượng photphophytate có trong hạt ngũ cốc và các loại đậu hay hạt cây có dầu không được các loài động vật hấp thu và đã thải ra ngoài môi trường qua phân của chúng. Vì vậy đã gây nên sự ô nhiễm phytate cho môi trường đất và nước. Phytase là một enzyme có khả năng phân giải phytate photpho để phóng thích photpho vô cơ, cung cấp lượng photpho cho cơ thể động vật. Do đó nó cũng có tiềm năng tác động để làm giảm sự ô nhiễm môi trường, bởi việc giảm sự bài tiết phytate và nitơ trong phân. Vì vậy, giá trị thương mại hóa của phytase vi sinh vật được ứng dụng để bổ sung vào thức ăn cho gia súc, gia cầm được chú ý nhiều hơn trong những năm gần đây. Tuy nhiên nguồn phytase thu nhận từ vi sinh vật có nhiều khuyết điểm như hoạt độ thấp, ít có khả năng chịu nhiệt, . Do đó người ta đã bắt đầu nghiên cứu để có thể thu nhận được nguồn phytase có hoạt độ cao hơn, có khả năng chịu nhiệt, pH, và các đặc tính khác, đó là nguồn phytase tái tổ hợp. Trong luận văn này, chúng tôi nghiên cứu thu nhận và tinh sạch phytase tái tổ hợp từ nấm men Pichia pastoris GS115 và xác định các đặc tính của enzyme này.
Mục lục
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình và biểu đồ
MỞ ĐẦU . 1
Chương 1: Tổng quan tài liệu 3
1.1 Acid phytic . 4
1.1.1 Cấu trúc hóa học của acid phytic . 4
1.1.2 Chức năng sinh lý của acid phytic . 5
1.1.3 Sự tạo thành, phân bố và hàm lượng của acid phytic trong tự nhiên 6
1.1.4 Tác động kháng dưỡng của acid phytic . 7
1.2 Enzym phytase và phytase của Aspergillus ficuum . 7
1.2.1 Định nghĩa 7
1.2.2 Lịch sử các nghiên cứu về phytase 8
1.2.3 Phân loại 9
1.2.3.1 Phân loại dựa trên nhóm phosphate đầu tiên bị enzyme tác động . 9
1.2.3.2 Phân loại dựa vào đặc điểm sinh hóa và trình tự acid amin . 9
1.2.4 Nguồn thu nhận enzyme phytase . 10
1.2.4.1 Phytase từ động vật 10
1.2.4.2 Phytase từ thực vật . 11
1.2.4.3 Phytase có nguồn gốc từ vi sinh vật 12
1.2.5 Đặc tính sinh hóa . 15
1.2.5.1 Nhiệt độ và độ pH tối ưu 15
1.2.5.2 Trọng lượng phân tử . 16
1.2.5.3 Cơ chất 17
1.2.5.4 Thành phần amino acid của phyA và phyB trong A. ficuum 18
1.2.6 Đặc điểm xúc tác của enzym phytase 18
1.2.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme . 20
1.2.7.1 Ion kim loại 20
1.2.7.2 Canxi và tỷ lệ Canxi/phospho 21
1.2.7.3 Nồng độ cơ chất . 21
1.2.8 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym phytase . 21
1.2.8.1 Nguồn cacbon 21
1.2.8.2 Nguồn nitơ . 22
1.2.8.3 Vitamin và các nguyên tố vi lượng 22
1.2.8.4 Tỷ lệ cacbon/photpho 23
1.2.9 Ứng dụng của enzym phytase 23
1.2.9.1 Ứng dụng trong nghiệp chế biến thức ăn gia súc, gia cầm .
1.2.9.2 Ứng dụng trong công nghệ thực phẩm 24
1.2.9.3 Ứng dụng trong công nghệ tổng hợp myoinositol phosphate . 25
1.2.10 Các nghiên cứu về phytase ở Việt Nam 26
1.3 Nấm men Pichia pastoris . 27
1.3.1 Phân loại và đặc điểm chung . 27
1.3.2 Những ưu điểm của hệ thống biểu hiện Pichia pastoris 28
1.3.3 Biến dưỡng methanol ở P. pastoris . 30
1.3.4 Sự tiết các protein ngoại lai . 31
1.3.5 Biến đổi hậu dịch mã . 32
1.3.6 Các chủng biểu hiện phổ biến 33
1.3.7 Các vector biểu hiện 34
1.3.8 Pichia pastoris GS115 đã biến nạp 35
Chương 2: Vật liệu & Phương pháp 38
2.1 Vật liệu . 39
2.1.1 Nguyên vật liệu 39
2.1.2 Hóa Chất và môi trường 39
2.1.2.1 Hóa chất . 39
2.1.2.2 Môi trường nuôi cấy 41
2.1.3 Dụng cụ và thiết bị . 42
2.2 Các phương pháp sử dụng 43
2.2.1 Phương pháp xác định hàm lượng protein: 43
2.2.2 Phương pháp xác định hoạt tính phytase . 45
2.2.3 Phương pháp chạy điện di SDS-PAGE . 48
2.2.4 Phương pháp sắc ký lọc gel . 52
2.2.5 Phương pháp thẩm tích (Dialyse) để loại muối . 54
2.2.6 Phương pháp xác định hằng số Michaelis (Km) . 55
2.3 Phương pháp nghiên cứu: . 58
2.3.1 Kiểm tra khả năng sinh tổng hợp phytase 58
2.3.2 Khảo sát các điệu kiện ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy, lên men thu nhận phytase tái tổ hợp 59
2.3.2.1 Tỷ lệ giống . 59
2.3.2.2 Thời gian nuôi cấy 60
2.3.2.3 Môi trường nuôi cấy . 60
2.3.2.4 Lượng methanol bổ sung trong quá trình nuôi cấy . 61
2.3.2.5 Nồng độ K3PO4 bổ sung vào môi trường nuôi cấy 61
2.3.3 Ảnh hưởng của các tác nhân tủa 62
2.3.4 Xác định hiệu quả của quá trình nuôi cấy 62
2.3.5 Khảo sát các nhân tố ảnh hưởng đến hoạt tính phytase . 63
2.3.5.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ . 63
2.3.5.2 Ảnh hưởng của pH . 63
2.3.5.3 Ảnh hưởng của các ion kim loại 64
2.3.5.4 Nhiệt độ tối ưu (topt) của enzym phytase thu nhận được 64
2.3.6 Tinh sạch enzym phytase thu được bằng phương pháp sắc ký lọc gel . 64
2.3.7 Điện di SDS-PAGE . 65
2.3.8 Khảo sát các đặc tính của phytase thu được sau khi qua sắc ký lọc gel 65
2.3.8.1 Khảo sát nồng độ cơ chất theo thời gian để tìm ra giá trị Km (hằng số Michaelis) của enzym 65
2.3.8.2 Xác định Km 65
2.4 Tóm tắt qui trình thu nhận phytase tái tổ hợp 66
Chương 3: Kết quả & Biện luận . 67
3.1 Kiểm tra khả năng sinh phytase của các giống 68
3.2 Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy thu nhận phyase . 69
3.2.1 Khảo sát tỷ lệ giống cấy . 69
3.2.2 Khảo sát thời gian nuôi cấy . 71
3.2.3 Khảo sát môi trường nuôi cấy 73
3.2.4 Khảo sát lượng methanol bổ sung mỗi 24 giờ trong quá trình nuôi cấy . 75
3.2.5 Khảo sát nồng độ K3PO4 bổ sung vào môi trường nuôi cấy . 77
3.3 Khảo sát sự ảnh hưởng của các tác nhân tủa lên hoạt tính phytase . 80
3.4 Xác định hiệu quả nuôi cấy thu nhận phytase tái tổ hợp . 82
3.5 Khảo sát các nhân tố ảnh hưởng đến hoạt tính phytase . 84
3.5.1 Khảo sát sự bền nhiệt của phytase tái tổ hợp . 84
3.5.2 Khảo sát sự ảnh hưởng của pH . 87
3.5.3 Khảo sát sự ảnh hưởng của các ion kim loại 90
3.5.4 Xác định nhiệt độ tối ưu 92
3.6 Tinh sạch enzyme phytase thu nhận được . 94
Luận Văn Thạc Sĩ Mục Lục
HVTH: Lê Thị Ngọc Sương CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh
3.6.1 Chạy sắc ký với enzyme phytase tái tổ hợp thu nhận được, chưa qua loại muối 94
3.6.2 Chạy sắc ký với enzyme phytase tái tổ hợp đã qua loại muối . 96
3.6.3 Xác định hiệu suất của quá trình sắc ký lọc gel . 98
3.7 Điện di SDS-PAGE 100
3.8 Hằng số Michaelis (Km) 103
Chương 4: Kết luận & Đề nghị . 107
4.1 Kết luận 108
4.1.1 Các điều kiện liên quan đến quá trình nuôi cấy . 108
4.1.2 Tác nhân tủa 108
4.1.3 Hiệu quả thu nhận phytase tái tổ hợp . 108
4.1.4 Các nhân tố ảnh hưởng đến hoạt tính phytase 109
4.2 Đề nghị . 109
TÀI LIỆU THAM KHẢO 111
Chương 5: Phụ lục