Tài liệu Nghiên cứu thu nhận và tạo dòng gen mã hóa cellulase từ vi khuẩn bacillus subtilis

NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ TẠO DÒNG GEN MÃ HÓA CELLULASE
TỪ VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS
RESEARCH AND CLONING A GENE ENCODING CELLULASE FROM BACILLUS SUBTILIS


TÓM TẮT
Enzyme cellulase được ứng dụng nhiều trong môi nông trường, nông nghiệp, công nghiệp, y học, .Tuy nhiên tại Việt Nam việc sản xuất chế phẩm enzyme này vẫn chưa thực sự hoàn thiện. Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành tạo dòng đoạn gen mã hóa endo-1,4-beta- glucanase thuộc hệ enzyme cellulase từ vi khuẩn Bacillus subtilis. Đoạn gen sau khi tạo dòng thành công được bước đầu biểu hiện trong chủng E.coli BL21(DE3) cảm ứng bằng IPTG 1mM. Hoạt tính của enzyme được kiểm tra bằng phương pháp thủy phân trên môi trường thạch chứa CMC (carbo-metyl-cellulose) 1% và phương pháp đường khử Bermeld. Đồng thời chúng tôi kiểm tra kích thước của enzyme mục tiêu bằng điện di SDS-PAGE. Kết quả này sẽ làm nền tảng cho việc sản xuất chế phẩm enzyme cellulase phục vụ trong nhiều ngành công nghiệp sau này.
ABSTRACT
Cellulase enzyme plays a critical role in many fields such as agriculture, industry, medicine, etc. However, production of this enzyme still haven't been completed. In this study, we carried out cloning the gene endo-1,4-beta-glucanase which is coding for the biosynthesis of cellulose on the Bacillus subtilis DNA. The cloning gene is represented on the expression system of E.coli BL21(DE3) and induced with 1mM IPTG. The producing enzyme is test for activity on the medium with CMC (carbo-metyl-cellulose) 1% and the reducing sugar Bermeld. As the same time, we check the size of the target enzyme by SDS-PAGE. This result will base for the manufacturing cellulase which is using for many industry application.


1. Đặt vấn đề


Enzyme cellulase được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực: nông nghiệp, công nghiệp, y học, môi trường, . Trong nông nghiệp và công nghiệp thực phẩm: enzyme này được dùng để chế biến thức ăn cho vật nuôi, cải thiện giá trị dinh dưỡng của thức ăn gia súc, gia cầm. Trong y học: cellulase được dùng để trích ly các chất từ cây thuốc, tạo nên những bước phát triển vượt bậc cho ngành công nghiệp dược phẩm. Ngoài ra, cellulase còn được ứng dụng trong quy trình tạo cồn sinh học hướng đến việc tạo ra nguồn nhiên liệu thay thế dần cho nguồn dầu mỏ đang ngày càng cạn kiêt [4].
Các chủng vi khuẩn như Bacillus subtilis, vi nấm như Tricodeman, có khả năng sinh enzyme cellulase mạnh. Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành thu nhận và tạo dòng gen mã hóa cho endo-1,4-betaglucanase từ vi khuẩn Bacillus subtilis. Đề tài nếu được khai thác triệt để sẽ là bước tiến quan trọng, là cơ sở để hướng đến việc thu nhận và sản xuất chế phẩm enzyme cellulase thương mại với giá thành hợp lý.


2. Kết quả nghiên cứu và khảo sát



2.1. Kết quả thu nhận DNA bộ gen từ Bacillus subtilis
Để thu nhận gen mã hóa cho enzyme endo-1,4-betaglucanase, chúng tôi sử dụng bộ gen của vi khuẩn Bacillus subtilis làm mạch khuôn. Theo các nghiên cứu trước được tiến hành tại phòng thí nghiệm công nghệ sinh học – Đại học Bách Khoa Đà Nẵng chủng vi khuẩn này đã được chứng minh có khả năng sinh enzyme cellulase mạnh. Do vậy, đầu tiên chúng tôi tiến hành tách chiết DNA bộ gen bằng phương pháp SDS-kiềm. Kết quả thu được điện di trên gel agarose 1% như sau:








Từ kết quả điện di cho ta thấy chúng tôi đã thu nhận được DNA bộ gen Bacillus subtilis nguyên vẹn. DNA có thể tiếp tục sử dụng để thực hiện nhân bản thu gen mục tiêu.










Hình 1 Kết quả tách DNA bộ gen Bacillus subtilis
Giếng M: Thang DNA 100bp (Biorad)
Giếng 1: DNA bộ gen Bacillus subtilis
2.2. Kết quả nhân bản đoạn gen endo-1,4-betaglucanase
Trên cơ sở DNA thu được, chúng tôi tiến hành phản ứng OE PCR (overlap extension PCR) để thu nhận đoạn gen mong muốn . Phản ứng PCR đầu được tiến hành hai phản ứng với hai cặp mồi F1 và R1, F2 và R2 với chu trình nhiệt: 950C trong 5 phút, 940C trong 1 phút, 520C trong 45 giây, 720C trong 1 phút 30 giây, 720C trong 10 phút (lặp lại 35 chu kì) để thu được hai đoạn gen có kích thước khoảng 900 bp, 700 bp. Phản ứng PCR thứ hai sử dụng sản phẩm của hai phản ứng PCR đầu làm nguyên liệu (template) chạy với chu trình nhiệt như trên 25 chu kì sau đó bổ sung mồi F1&R2 chạy tiếp tục 30 chu kì với mục đích thu được đoạn gen có kích thước 1600 bp [2]. Mồi F1, R2 được thiết kế có vị trí cắt của enzyme BamHI và XhoI tương ứng. Các kết quả PCR được điện di kiểm tra trên gel
agarose 1% như sau: