Thạc Sĩ Nghiên cứu thu nhận và biểu hiện gen mã hóa cellulase

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
Chuyên ngành: Vi sinh
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Năm 2012

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Tổng hợp đặc điểm cấu trúc, hoạt tính và nguồn gốc các họ cellulase GH . 10
Bảng 3.1. Trình tự các cặp mồi thoái hóa được thiết kế dựa trên vùng bảo tồn trình tự
axit amin trên cellulase để nhân bản gen mã hóa cellulase bằng phản ứng PCR . 43
Bảng 3.2. Trình tự các cặp mồi được thiết kế dựa trên vùng bảo tồn trình tự nucleotide trên gen mã hóa cellulase để nhân bản gen này bằng phản ứng PCR 44
Bảng 3.3. Trình tự các cặp mồi được thiết kế dựa trên vùng bảo tồn trình tự nucleotide trên gen mã hóa cellulase để nhân bản gen này ở xạ nhuẩn Streptomyces bằng phản ứng PCR . 55
Bảng 3.4. Trình tự các cặp mồi thiết kế để nhân bản các gen celA, celB, celS, celT
bằng phản ứng PCR, tạo dòng và tái tạo dòng 59
Bảng 4.1. Lượng metagenome DNA thu được từ 4 mẫu đất và độ sạch protein 68
Bảng 4.2. Các chủng xạ khuẩn phân lập từ các mẫu đất ở Vườn Quốc gia Nam Cát
Tiên được có hoạt tính cellulase 80


DANH MỤC HÌNH, ĐỒ THỊ

Hình 1.1. Các enzyme thủy phân tinh bột . 4
Hình 1.2. Cấu trúc của amylose và amylopectin . 11
Hình 1.3. Cấu tạo Maltose . 19
Hình 1.4. Công thức cấu tạo glucose (dạng mạch hở và 2 dạng mạch vòng α-glucose, β-glucose) . 21
Hình 1.5. Máy HPLC . 24
Hình 1.6. Mô hình hệ thống HPLC điển hình 24
Hình 3.1. Dung dịch thu được: trước (trái) và sau (phải) khi ly tâm và xử lý bằng than hoạt tính. (Tương ứng ống 1: bột bắp,
ống 2: bột gạo, ống 3: bột năng) 74

BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1. So sánh lượng đường khử tạo thành khi thủy phân tinh bột
bằng tác nhân acid HCl trên các nguồn cơ chất khác nhau 50
Biểu đồ 3.2. So sánh lượng đường khử tạo ra trong quá trình dịch hóa
bằng enzyme Termamyl trên các nguồn cơ chất khác nhau 56
Biểu đồ 3.3. So sánh lượng đường khử tạo thành trong quá trình
đường hóa bằng enzyme Sebamyl trên các nguồn cơ chất khác nhau . 61
Biểu đồ 3.4. So sánh lượng đường khử tạo thành trong quá trình
đường hóa bằng enzyme AMG-E trên các nguồn cơ chất khác nhau 65
Biểu đồ 3.5. So sánh lượng đường khử tạo ra trong quá trình dịch hóa bằng acid và đường hóa bằng enzyme Sebamyl trên các nguồn
cơ chất khác nhau . 70
Biểu đồ 3.6. So sánh lượng đường khử tạo thành trong quá trình dịch hóa bằng acid và đường hóa bằng enzyme AMG trên

các nguồn cơ chất khác nhau 74


ĐỒ THỊ

Đồ thị 3.1. Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian
thủy phân bằng acid HCl trên bột gạo và giá trị DE 46
Đồ thị 3.2. Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian
thủy phân bằng acid HCl trên bột bắp và giá trị DE 47
Đồ thị 3.3. Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian
thủy phân bằng acid HCl trên bột năng và giá trị DE 48
Đồ thị 3.4. Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian
thủy phân bằng acid HCl trên tinh bột tan và giá trị DE 49
Đồ thị 3.5. Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời
gian thủy phân bằng enzyme Termamyl trên bột gạo và giá trị DE 52
Đồ thị 3.6. Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian
thủy phân bằng enzyme Termamyl trên bột bắp và giá trị DE 53
Đồ thị 3.7. Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian
thủy phân bằng enzyme Termamyl trên bột năng và giá trị DE 54
Đồ thị 3.8. Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian
thủy phân bằng enzyme Sebamyl trên bột gạo và giá trị DE . 57
Đồ thị 3.9. Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian
thủy phân bằng enzyme Sebamyl trên bột bắp và giá trị DE . 58
Đồ thị 3.10. Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian
thủy phân bằng enzyme Sebamyl trên bột năng và giá trị DE . 59
Đồ thị 3.11. Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian
thủy phân bằng enzyme AMG-E trên bột gạo và giá trị DE 62
Đồ thị 3.12. Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian
thủy phân bằng enzyme AMG-E bột bắp và giá trị DE . 63
Đồ thị 3.13. Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian

thủy phân bằng enzyme AMG-E bột năng và giá trị DE . 64
Đồ thị 3.14. Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian thủy phân bằng enzyme Sebamyl sau khi dịch hóa bằng acid HCl
trên bột gạo và giá trị DE . 67
Đồ thị 3.15. Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian thủy phân bằng enzyme Sebamyl sau khi dịch hóa bằng acid HCl
trên bột bắp và giá trị DE . 68
Đồ thị 3.16. Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian thủy phân bằng enzyme Sebamyl sau khi dịch hóa bằng acid HCl
trên bột năng và giá trị DE . 69
Đồ thị 3.17. Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian thủy phân bằng enzyme AMG-E sau khi dịch hóa bằng acid HCl
trên bột gạo và giá trị DE . 71
Đồ thị 3.18. Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian thủy phân bằng enzyme AMG-E sau khi dịch hóa bằng acid HCl
trên bột bắp và giá trị DE . 72
Đồ thị 3.19. Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian thủy phân bằng enzyme AMG-E sau khi dịch hóa bằng acid HCl
trên bột năng và giá trị DE . 73



CHƯƠNG 1.


1.1 MỞ ĐẦU

Cellulose và hemicellulose là các đường cao phân tử do thực vật sinh tổng hợp, chiếm khoảng 40-50% vách tế bào thực vật và là bộ phận sinh khối lớn nhất trên trái đất. Việc chuyển hóa hữu hiệu phần sinh khối này bằng vi sinh vật được cải thiện di truyền là rất cần thiết, cho phép biến các polysaccharide tương đối khó thủy phân này thành các sản phẩm có giá trị như axít amin, dung môi hữu cơ. Đặc biệt, việc chuyển hóa hữu hiệu cellulose và hemicellulose thành các nhiên liệu tái sinh như ethanol và methane là một cách tiếp cận chiến lược để tạo giá trị gia tăng cho các phế liệu, phế phẩm nông lâm nghiệp, đồng thời là một trong các chiến lược về năng lượng mới để giảm sự phụ thuộc của hoạt động sản xuất, đời sống của nhân loại vào nguồn năng lượng dầu hỏa đang nhanh chóng bị cạn kiệt.
Tại Việt Nam, các nghiên cứu về cellulase cho đến nay tập trung vào việc ứng dụng enzym này để thủy phân cellulose từ sinh khối và từ phế liệu nông lâm nghiệp, phục vụ cho các ứng dụng về xử lý chất thải rắn, về môi trường. Do vậy, các nghiên cứu thường tập trung vào việc phân lập vi sinh vật có hoạt tính cellulase cao, có khả năng chịu nhiệt và ứng dụng các chủng vi sinh vật này. Hướng nghiên cứu và ứng dụng của cellulase ở dạng protein enzym đã được tách chiết còn ít. Tương tự, hầu như chưa có nghiên cứu nào được thực hiện ở mức gen hoặc cellulase được cải biến bằng kỹ thuật gen. Mặt khác, các nghiên cứu theo hướng ứng dụng cellulase nhằm chuyển hóa sinh khối thực vật thành dung môi và nhiên liệu liệu tái sinh còn rất ít được quan tâm.
Cho đến nay, khi muốn tìm và phân lập enzym có những đặc điểm mới từ vi sinh vật trong tự nhiên, chúng ta phải sử dụng phương pháp tiếp cận kinh điển là nuôi cấy rất nhiều vi sinh vật khác nhau để sàng lọc, tìm loài, chủng có đặc điểm kiểu hình mong muốn, sau đó phân lập tinh chế enzym hoặc phân lập gen và biểu hiện gen để thu nhận enzym. Do trên 99% vi sinh vật trong tự nhiên chưa có thể nuôi cấy được, cho nên với phương pháp này, chúng ta không có khả năng tiếp cận được và bị thất thoát đại bộ phận của nguồn gen vi sinh vật quý trong tự nhiên.


Một cách tiếp cận mới được đề xuất trong vòng 10 năm gần đây để thu nhận enzym từ toàn bộ nguồn gen phong phú trong tự nhiên không qua phương pháp nuôi cấy được gọi là kỹ thuật đa bộ gen (metagenomics). Trong kỹ thuật này, gen quan tâm trong nguồn gen tự nhiên được phân lập trực tiếp bằng các phân tích chức năng hoặc dựa trên trình tự gen. Kỹ thuật tiên tiến này có triển vọng ứng dụng rất lớn trong việc khai thác hữu hiệu tài nguyên vi sinh vật trong tự nhiên.
Năm 2006 một nhiệm vụ hợp tác quốc tế về khoa học và công nghệ theo nghị định thư Việt – Đức “Xây dựng chip tế bào có khả năng phân hủy cellulose” đã được Bộ Khoa học và Công nghệ giao cho Trường Đại học Khoa học Tự nhiên thuộc Đại học Quốc gia TP.HCM chủ trì. Nội dung của nhiệm vụ này bao gồm việc ứng dụng kỹ thuật metagenomics để tìm, phân lập các gen mã hóa enzym cellulase thủy phân cellulose từ các nguồn phân lập tự nhiên khác nhau của Việt Nam; sử dụng các gen này để tạo ra các dòng tế bào vi khuẩn như Bacillus subtilis có cellulase được gắn cộng hóa trị trên bề mặt vách tế bào, được gọi là các chip cellulase để ứng dụng theo hướng chuyển hóa sinh khối thực vật thành dung môi và nhiên liệu liệu tái sinh.
Luận văn này nhằm nghiên cứu thu nhận gen mã hóa cellulase, làm nguyên liệu để phát triển chip cellulase, phục vụ và là một bộ phận của nhiệm vụ hợp tác quốc tế nêu trên.
Để thu nhận được gen mã hóa cellulase, luận văn đã tiến hành 03 cách tiếp cận khác nhau:
- Thu nhận gen mã hóa cellulase bằng kỹ thuật metagenomics từ đất.
- Thu nhận gen mã hóa cellulase từ các chủng xạ khuẩn có hoạt tính cellulase phân lập từ Vườn Quốc gia Nam Cát Tiên.
- Thu nhận các gen mã hóa cellulase từ vi khuẩn Clostridium thermocellum.