Thạc Sĩ Nghiên cứu thu nhận và biểu hiện gen mã hóa cellulase

MỞ ĐẦU

Cellulose và hemicellulose là các đường cao phân tử do thực vật sinh tổng hợp, chiếm khoảng 40-50% vách tế bào thực vật và là bộ phận sinh khối lớn nhất trên trái đất. Việc chuyển hóa hữu hiệu phần sinh khối này bằng vi sinh vật được cải thiện di truyền là rất cần thiết, cho phép biến các polysaccharide tương đối khó thủy phân này thành các sản phẩm có giá trị như axít amin, dung môi hữu cơ. Đặc biệt, việc chuyển hóa hữu hiệu cellulose và hemicellulose thành các nhiên liệu tái sinh như ethanol và methane là một cách tiếp cận chiến lược để tạo giá trị gia tăng cho các phế liệu, phế phẩm nông lâm nghiệp, đồng thời là một trong các chiến lược về năng lượng mới để giảm sự phụ thuộc của hoạt động sản xuất, đời sống của nhân loại vào nguồn năng lượng dầu hỏa đang nhanh chóng bị cạn kiệt.
Tại Việt Nam, các nghiên cứu về cellulase cho đến nay tập trung vào việc ứng dụng enzym này để thủy phân cellulose từ sinh khối và từ phế liệu nông lâm nghiệp, phục vụ cho các ứng dụng về xử lý chất thải rắn, về môi trường. Do vậy, các nghiên cứu thường tập trung vào việc phân lập vi sinh vật có hoạt tính cellulase cao, có khả năng chịu nhiệt và ứng dụng các chủng vi sinh vật này. Hướng nghiên cứu và ứng dụng của cellulase ở dạng protein enzym đã được tách chiết còn ít. Tương tự, hầu như chưa có nghiên cứu nào được thực hiện ở mức gen hoặc cellulase được cải biến bằng kỹ thuật gen. Mặt khác, các nghiên cứu theo hướng ứng dụng cellulase nhằm chuyển hóa sinh khối thực vật thành dung môi và nhiên liệu liệu tái sinh còn rất ít được quan tâm.
Cho đến nay, khi muốn tìm và phân lập enzym có những đặc điểm mới từ vi sinh vật trong tự nhiên, chúng ta phải sử dụng phương pháp tiếp cận kinh điển là nuôi cấy rất nhiều vi sinh vật khác nhau để sàng lọc, tìm loài, chủng có đặc điểm kiểu hình mong muốn, sau đó phân lập tinh chế enzym hoặc phân lập gen và biểu hiện gen để thu nhận enzym. Do trên 99% vi sinh vật trong tự nhiên chưa có thể nuôi cấy được, cho nên với phương pháp này, chúng ta không có khả năng tiếp cận được và bị thất thoát đại bộ phận của nguồn gen vi sinh vật quý trong tự nhiên.
Một cách tiếp cận mới được đề xuất trong vòng 10 năm gần đây để thu nhận enzym từ toàn bộ nguồn gen phong phú trong tự nhiên không qua phương pháp nuôi cấy được gọi là kỹ thuật đa bộ gen (metagenomics). Trong kỹ thuật này, gen quan tâm trong nguồn gen tự nhiên được phân lập trực tiếp bằng các phân tích chức năng hoặc dựa trên trình tự gen. Kỹ thuật tiên tiến này có triển vọng ứng dụng rất lớn trong việc khai thác hữu hiệu tài nguyên vi sinh vật trong tự nhiên.
Năm 2006 một nhiệm vụ hợp tác quốc tế về khoa học và công nghệ theo nghị định thư Việt – Đức “Xây dựng chip tế bào có khả năng phân hủy cellulose” đã được Bộ Khoa học và Công nghệ giao cho Trường Đại học Khoa học Tự nhiên thuộc Đại học Quốc gia TP.HCM chủ trì. Nội dung của nhiệm vụ này bao gồm việc ứng dụng kỹ thuật metagenomics để tìm, phân lập các gen mã hóa enzym cellulase thủy phân cellulose từ các nguồn phân lập tự nhiên khác nhau của Việt Nam; sử dụng các gen này để tạo ra các dòng tế bào vi khuẩn như Bacillus subtilis có cellulase được gắn cộng hóa trị trên bề mặt vách tế bào, được gọi là các chip cellulase để ứng dụng theo hướng chuyển hóa sinh khối thực vật thành dung môi và nhiên liệu liệu tái sinh.
Luận văn này nhằm nghiên cứu thu nhận gen mã hóa cellulase, làm nguyên liệu để phát triển chip cellulase, phục vụ và là một bộ phận của nhiệm vụ hợp tác quốc tế nêu trên.
Để thu nhận được gen mã hóa cellulase, luận văn đã tiến hành 03 cách tiếp cận khác nhau:
- Thu nhận gen mã hóa cellulase bằng kỹ thuật metagenomics từ đất.
- Thu nhận gen mã hóa cellulase từ các chủng xạ khuẩn có hoạt tính cellulase phân lập từ Vườn Quốc gia Nam Cát Tiên.
- Thu nhận các gen mã hóa cellulase từ vi khuẩn Clostridium thermocellum.
1.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CỦA LUẬN VĂN
Nội dung nghiên cứu ban đầu được dự kiến thực hiện trong luận văn này là dùng kỹ thuật metagenomics để thu nhận gen mã hóa cellulase từ trong mẫu đất tự nhiên. Gen mã hóa cellulase thu được sẽ được làm vật liệu để tạo chip cellulase bằng công nghệ bề mặt tế bào Bacillus subtilis tế bào là sản phẩm chính của một nhiệm vụ hợp tác quốc tế về khoa học và công nghệ theo nghị định thư Việt – Đức “Xây dựng chip tế bào có khả năng phân hủy cellulase” đã được Bộ Khoa học và Công nghệ giao cho Trường Đại học Khoa học Tự nhiên thuộc Đại học Quốc gia TP.HCM chủ trì.
Tuy nhiên, trong quá trình nghiên cứu, dù đã nỗ lực rất nhiều nhưng học viên đã không thành công trong việc thu nhận được gen mã hóa cellulase từ các mẫu đất tự nhiên bằng kỹ thuật genomics. Do vậy, học viên đã triển khai thêm hai phương án khác để có được gen mã hóa cellulase là: (i) Thu nhận gen mã hóa cellulase từ xạ khuẩn có hoạt tính cellulase và (ii) Thu nhận gen mã hóa cellulase CelA và CelS từ vi khuẩn C. thermocellum.
1.2.1. Nghiên cứu thu nhận gen mã hóa cellulase bằng phương pháp metagenomics từ đất
Để thu nhận gen mã hóa cellulase bằng cách tiếp cận metagenomics, trong luận văn này học viên đã thực hiện các nội dung thực nghiệm sau:
- Thu nhận metagenome DNA từ 4 mẫu đất có đặc điểm sinh thái khác nhau.
- Nhân bản gen mã hóa cellulase bằng phản ứng PCR với các cặp mồi thoái hóa được thiết kế từ trình tự axit amin bảo tồn của các họ enzym cellulase trong cơ sở dữ liệu cellulase.
- Nhân bản gen mã hóa cellulase bằng phản ứng PCR với các cặp mồi được thiết kế từ trình tự nucelotide bảo tồn của gen mã hóa cellulase trong cơ sở dữ liệu cellulase.
-pMBD14 ) vào tế bào chủ E. coli.
- Sàng lọc gen mã hóa cellulase dựa trên chức năng từ thư viện metagenome dùng tế bào chủ là E. coli và tế bào chủ là Pseudomonas putida.
1.2.2. Nghiên cứu thu nhận gen mã hóa cellulase từ các chủng xạ khuẩn có hoạt tính cellulase phân lập từ Vườn quốc gia Nam Cát Tiên
Do học viên không thành công trong việc tạo dòng và thu nhận gen mã hóa cellulase từ đất bằng kỹ thuật metagenomics, học viên thực hiện một cách tiếp cận khác để có được gen mã hóa cellulase làm vật liệu để tạo chip cellulase tế bào là thu nhận gen mã hóa cellulase từ các chủng xạ khuẩn có hoạt tính cellulase được phân lập từ các mẫu đất của Vườn Quốc gia Nam Cát Tiên.
Trong một nghiên cứu khác liên quan đến tính đa dạng vi sinh vật lớp đất mặt ở Vườn Quốc gia Nam Cát Tiên, Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học phân tử Trường ĐH Khoa học Tự nhiên đã phân lập được 263 xạ khuẩn Streptomyces, trong số này có 29 chủng có hoạt tính cellulase. Học viên ly trích DNA bộ gen của các chủng này và nhân bản đoạn gen mã hóa cellulase bằng phản ứng PCR với cặp mồi với 36 cặp mồi được thiết kế từ vùng trình tự nucleotide bảo tồn của các trình tự gen mã hóa cellulase từ các chủng xạ khuẩn Streptomyces đã công bố và được sắp xếp trong cơ sở dữ liệu cellulase.
1.2.3. Nghiên cứu thu nhận các gen mã hóa cellulase từ vi khuẩn C. thermocellum
Mặc dù học viên đã thành công trong việc nhân bản 02 trình tự liên quan đến gen mã hóa cellulase từ các chủng xạ khuẩn Streptomyces có hoạt tính cellulase, tuy nhiên thời gian không cho phép học viên tiến hành thu nhận được toàn bộ 2 gen mã hóa cellulase này làm vật liệu để tạo chíp cellulase tế bào. Do vậy để có gen mã hóa cellulase dùng cho việc tạo chip cellulase tế bào, học viên tiến hành tạo dòng 02 gen mã hóa cellulase CelA và CelS của vi khuẩn C. thermocellum. Gen celA, celS mã hóa cho hai cellulase tương ứng được tổng hợp bằng phản ứng PCR. Các gen này được tạo dòng và biểu hiện trong E. coli để thu nhận enzym tái tổ hợp dùng làm kháng nguyên để tạo kháng thể đa dòng kháng các enzym tương ứng. Các kháng thể đa dòng này là công cụ cần cho việc đánh giá phân tích sự biểu hiện của cellulase trong các chip cellulase tế bào.

MỤC LỤC
Danh mục các chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình
CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU . 1
1.1 MỞ ĐẦU . 2
1.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CỦA LUẬN VĂN 4
1.2.1. Nghiên cứu thu nhận gen mã hóa cellulase bằng phương pháp
metagenomics từ đất 4
1.2.2. Nghiên cứu thu nhận gen mã hóa cellulase từ các chủng xạ khuẩn có hoạt
tính cellulase phân lập từ Vườn quốc gia Nam Cát Tiên 5
1.2.3. Nghiên cứu thu nhận các gen mã hóa cellulase từ vi khuẩn C.
Thermocellum 5
CHƯƠNG 2: TỒNG QUAN TÀI LIỆU 7
2.1. CELLULASE 8
2.1.1. Cellulose . 8
2.1.2. Phân loại cellulase 8
2.1.3. Các nhóm vi sinh vật có cellulase trong tự nhiên . 12
2.2. METAGENOMICS . 13
2.2.1 Metagenome và metagenomics 13
2.2.2 Các kỹ thuật trong nghiên cứu metagenomics . 13
2.3. XẠ KHUẨN TỔNG HỢP CELLULASE 18
2.3.1. Đại cương về xạ khuẩn 18
2.3.2. Nghiên cứu về xạ khuẩn có khả năng tổng hợp enzym cellulase 19
2.4. CELLULASE TỪ CLOSTRIDIUM THERMOCELLUM 21
2.4.1. Đặc tính cellulase của C. thermocellum 21
2.4.2. Phức hợp cellulosome . 22
2.4.3. Các nghiên cứu về gen và enzym cellulase từ C. thermocellum . 25
2.4.4. Các cellulase từ C. thermocellum được nghiên cứu trong luận văn 26
CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 28
3.1 VẬT LIỆU . 29
3.1.1 Dụng cụ và thiết bị . 29
3.1.2. Hóa chất . 29
3.1.3. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật 36
3.1.4. Vật liệu sinh học 39
3.2. PHƯƠNG PHÁP . 42
3.2.1. Thu nhận metagenome DNA từ đất 42
3.2.2. Nhân bản đoạn gen mã hóa cellulase từ metagenome DNA bằng phản
ứng PCR . 43
3.2.3. Xây dựng thư viện metagenome DNA 50
3.2.4. Sàng lọc dòng có hoạt tính cellulase từ thư viện metagenome DNA . 52
3.2.5. Sàng lọc các chủng xạ khuẩn có khả năng phân hủy cơ chất CMC 53
3.2.6. Ly trích genome DNA các chủng xạ khuẩn có hoạt tính thủy phân
CMC 54
3.2.7. Thu nhận đoạn gen mã hóa cellulase từ xạ khuẩn có hoạt tính thủy phân
CMC bằng phản ứng PCR 54
3.2.8. Thu nhận các gen mã hóa cellulase celA, celS của vi khuẩn Clostridium
thermocellum bằng phản ứng PCR . 57
3.2.9. Tạo các dòng E. coli biểu hiện các cellulase CelA, CelS của vi khuẩn
C.thermocellum . 61
3.2.10. Biểu hiện các gen celA, celS trong tế bào E. coli . 64
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN . 66
4.1. THU NHẬN GEN MÃ HÓA CELLULASE BẰNG PHƯƠNG PHÁP
METAGENOMICS 67
4.1.1. Thu nhận metagenome DNA . 67
4.1.2. Nhân bản gen mã hóa cellulase bằng phản ứng PCR dựa vào các cặp mồi
thoái hóa được thiết kế từ vùng bảo tồn trình tự axit amin 68
4.1.3. Nhân bản gen mã hóa cellulase bằng phản ứng PCR dựa vào các cặp mồi
được thiết kế từ vùng bảo tồn trình tự nucleotide 69
4.1.4. Xây dựng thư viện metagenome với pBluescript II SK (+) và plasmid
pMBD14 trong tế bào chủ E. coli .75
4.2. NGHIÊN CỨU THU NHẬN GEN MÃ HÓA CELLULASE TỪ CÁC
CHỦNG XẠ KHUẨN CÓ HOẠT TÍNH CELLULASE PHÂN LẬP TỪ
VƯỜN QUỐC GIA NAM CÁT TIÊN 79
4.2.1. Sàng lọc các chủng xạ khuẩn có hoạt tính thủy phân CMC 79
4.2.2. Thu nhận đoạn gen mã hóa cellulase từ xạ khuẩn có hoạt tính thủy phân
CMC bằng phản ứng PCR 80
4.3. TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN CÁC GEN MÃ HÓA CELLULASE TỪ VI
KHUẨN CLOSTRIDIUM THERMOCELLUM . .87
4.3.1. Thu nhận các gen mã hóa cellulase celA, celS của vi khuẩn Clostridium
thermocellum bằng phản ứng PCR . 87
4.3.2. Tạo dòng các gen celA, celS trong pBluescript II SK(+) và E. coli
DH5α . 88
4.3.3. Tạo các dòng E. coli biểu hiện các cellulase CelA, CelS của vi khuẩn C.
Thermocellum . 90
4.3.4. Biểu hiện các cellulase CelA, CelS của vi khuẩn C. thermocellum trong
E.coli . 98
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN . 101
Tài liệu tham khảo . 105