Thạc Sĩ Nghiên cứu thu nhận, tinh sạch và xác định tính chất của chitinase từ mủ cây cao su hevea brasiliens

MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN . i
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT . .ii
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU .iii
DANH MỤC CÁC HÌNH . .iv
DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ . .v
LỜI MỞ ĐẦU .vi
Phần I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .1
I.1. Sơ lược về chitin và chitinase . 1
I.1.1. Chitin 1
I.1.2. Chitinase (EC 3.2.1.14) . .5
I.1.2.1. Phân loại chitinase . .6
I.1.2.2. Các nguồn thu nhận enzyme chitinase . .9
I.1.2.3. Các đặc tính cơ bản của enzyme chitinase . 12
I.1.2.4. Các loại cơ chất của enzyme chitinase . 15
I.1.2.5. Cơ chế tác động của các loại enzyme chitinase . 16
I.1.2.6. Ứng dụng của chitinase . .17
I.2. Cây cao su Hevea brasiliensis và chitinase trong mủ cao su .20
I.2.1. Cây cao su .20
I.2.2. Mủ cao su 24
I.2.3. Hevamin . 32
Phần II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP . .37
II.1. Vật liệu .37
II.2. Phương pháp . .37
II.2.1. Phương pháp ly tâm mủ thu nhận lutoid .37
II.2.2. Kết tủa protein bằng dung môi hữu cơ 38
II.2.3. Kết tủa protein bằng muối trung tính 38
II.2.4. Thẩm tích .39
II.2.5. Xác định hàm lượng protein hòa tan theo phương pháp Lowry .40
II.2.6. Xác định hoạt độ chitinase theo phương pháp định lượng đường khử với thuốc thử DNS
42
II.2.7. Tinh sạch enzyme bằng phương pháp lọc gel Sephadex .4 5
II.2.8. SDS-PAGE 46
II.2.9. Xác định nhiệt độ tối ưu cho hoạt tính chitinase .50
II.2.10. Xác định pH tối ưu cho hoạt tính chitinase . .50
II.2.11. Xác định nồng độ cơ chất tối ưu cho hoạt tính chitinase . .51
II.2.12. Ảnh hưởng của ion kim loại .51
Phần III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 52
III.1. Quy trình tách chiết, thu nhận chitinase thô từ mủ cao su 52
III.1.1. Quy trình ly tâm tách mủ, thu hồi lutoid và phá vỡ lutoid để giải phóng chitinase .
.52
III.1.2. Quy trình tủa để thu nhận chitinase thô 52
III.1.2.1. Tủa bằng cồn để thu nhận chitinase thô .52
III.1.2.2. Tủa bằng acetone để thu nhận chitinase thô 54
III.1.2.3.Tủa bằng muối ammonium sulfate để thu nhận chitinase thô .55
III.2. Quy trình tinh sạch chitinase bằng phương pháp lọc gel Sephadex .58
III.2.1. Hàm lượng protein và hoạt tính chitinase trước lọc gel . .58
III.2.2. Kết quả đo OD 280nm các phân đoạn lọc gel ở 3 giống cao su . 59
III.2.3. Hàm lượng protein và hoạt tính chitinase sau lọc gel . 61
III.2.4. Hiệu suất hàm lượng protein và hoạt tính chitinase thu được qua lọc gel .63
III.2.5. Hiệu suất thu hồi chitinase từ mủ cao su .63
III.2.6. Kết quả điện di SDS-PAGE các giống cao su qua lọc gel .64
III.3. Xác định các tính chất của chitinase . 67
III.3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ . .67
III.3.2. Ảnh hưởng của pH 69
III.3.3. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất 71
III.3.4. Aûnh hưởng của các ion kim loại 73
III.3.5. Quy trình thu nhận enzyme chitinase từ mủ cao su .76
Phần IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 78
IV.1. Kết luận 78
IV.2. Đề nghị .78
TÀI LIỆU THAM KHẢO .80
PHỤ LỤC . .84