Tiến Sĩ Nghiên cứu thu nhận hoạt chất kìm hãm α-glucosidaza từ Aspergillus oryzae và hướng ứng dụng

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU . 1
1. Đặt vấn đề 1
2. Nội dung 2
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu . 3
4. Những đóng góp mới, ý nghĩa khoa học và tính thực tiễn của luận án . 4
5. Bố cục luận án . 5
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 6
1.1. Bệnh đái tháo đường (ĐTĐ) . 6
1.1.1. Khái niệm ĐTĐ . 6
1.1.2. Phương pháp điều trị bệnh ĐTĐ . 7
1.2. Cơ sở khoa học của việc sử dụng AGIs đến quá trình trao đổi đường trong cơ thể . 8
1.2.1. Enzyme α-glucosidase . 8
1.2.1.1. Sơ lược về enzyme . 8
1.2.1.2. Giới thiệu về enzyme α - glucosidase . 8
1.2.2. Cơ sở khoa học sử dụng AGIs để điều trị bệnh ĐTĐ 9
1.3. Chất kìm hãm α-glucosidase (alpha-Glucosidase inhibitor) (AGIs) 11
1.3.1. Các AGIs từ tổng hợp 12
1.3.2. AGIs từ động vật . 12
1.3.3. AGIs từ thực vật 12
1.3.4. AGIs từ vi sinh vật . 14
1.3.5. AGIs từ A.oryzae . 15
1.4. Đỗ đen và các sản phẩm lên men bề mặt từ đậu đỗ 16
1.4.1. Đỗ đen . 16
1.4.2. Sản phẩm lên men bề mặt từ đậu đỗ 17
1.5. A.oryzae và lên men bề mặt 19
1.5.1. Đặc điểm hình thái A.oryzae . 19
1.5.2. Ảnh hưởng thành phần môi trường đến sinh trưởng và hình thành AGIs bằng
A.oryzae . 21
1.5.2.1. Ảnh hưởng của nguồn carbon 22
1.5.2.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ . 23
1.5.2.3. Ảnh hưởng của nguồn khoáng dinh dưỡng 23
1.5.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và hình thành AGIs bằng
A.oryzae . 24
1.5.3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy . 24
1.5.3.2. Độ ẩm môi trường 24
1.5.3.3. Ảnh hưởng độ thoáng khí . 25
1.5.3.4. Điều kiện pH ban đầu của môi trường . 25
1.5.3.5. Tỷ lệ giống 26
1.5.3.6. Thời gian lên men . 27
1.6. Thu nhận AGIs . 27
1.6.1. Chiết xuất AGIs từ sản phẩm môi trường sau lên men . 27
1.6.2. Tinh sạch AGIs 29
1.7. Ứng dụng sóng siêu âm trong chiết xuất 30
1.8. Nghiên cứu, thử nghiệm và ứng dụng AGIs từ đậu đỗ lên men trên thế giới 35
1.9. Nghiên cứu và ứng dụng AGIs ở Việt Nam . 39
Chương 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 41
2.1. Nguyên vật liệu nghiên cứu 41
2.1.1. Các nguồn vi sinh vật và vật liệu . 41
2.1.2. Hóa chất . 41
2.1.3. Môi trường . 42
2.1.3.1. Môi trường nuôi cấy phân lập và giữ giống . 42
2.1.3.2. Môi trường nghiên cứu định loại Aspergillus . 42
2.1.3.3. Môi trường đậu đỗ giá thể rắn . 42
2.1.3.4. Các môi trường rắn cho nhân giống 42
2.1.3.5. Đỗ đen lên men . 43
2.1.4. Thiết bị . 43
2.1.5. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 43
2.1.5.1. Địa điểm nghiên cứu . 43
2.1.5.2. Thời gian nghiên cứu 43
2.2. Phương pháp phân tích và đo đạc . 44
2.2.1. Phương pháp xác định mật độ tế bào nấm mốc . 44
2.2.2. Xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase . 44
2.2.2.1. Xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase của môi trường sau lên men theo
phương pháp của Yamaki và Mori (2006) . 44
2.2.2.2. Xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase của dịch chiết xuất bằng dung môi 45
2.2.2.3. Phương pháp xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase theo Toomoyuki và
cộng sự, (1999) 45
2.2.2.4. Hoạt lực kìm hãm α-glucosidase (giá trị IC 50 ) . 45
2.2.3. Xác định hàm lượng protein, lipit, carbonhydrate và độ ẩm trong các sản phẩm
thực phẩm 46
2.2.4. Phương pháp phân tích cảm quan 46
2.2.5. Phương pháp tính toán, đánh giá hiệu quả tinh sạch chế phẩm AGIs kỹ thuật . 47
2.2.6. Phương pháp phân tích các chỉ tiêu an toàn thực phẩm 47
2.2.7. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu 47
2.3. Phương pháp nghiên cứu 48
2.3.1. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát . 48
2.3.2. Tuyển chọn A.oryzae có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao 49
2.3.2.1. Phân lập A.oryzae . 49
2.3.2.2. Tuyển chọn chủng nấm có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao 50
2.3.2.3. Định danh chủng nấm tuyển chọn được dựa trên so sánh trình tự gen vùng ITS1
- 5,8S - ITS2 . 50
2.3.3. Xác định một số yếu tố ảnh hưởng tới sinh trưởng của A.oryzae T6 trong nhân
giống trên môi trường rắn 52
2.3.3.1. Ảnh hưởng của thành phần cơ chất môi trường rắn đến sinh trưởng của
A.oryzae T6 52
2.3.3.2. Ảnh hưởng của thành phần tỷ lệ trấu trong môi trường rắn đến sinh trưởng của
A.oryzae T6 52
2.3.3.3. Ảnh hưởng độ ẩm ban đầu của môi trường nhân giống đến sinh trưởng của
A.oryzae T6 52
2.3.3.4. Ảnh hưởng pH ban đầu của môi trường nhân giống đến sinh trưởng của
A.oryzae T6 52
2.3.3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ nhân giống đến sinh trưởng của A.oryzae T6 . 52
2.3.3.6. Ảnh hưởng của độ dày khối môi trường nhân giống đến sinh trưởng của
A.oryzae T6 53
2.3.3.7. Ảnh hưởng của thời gian nhân giống đến sinh trưởng của A.oryzae T6 53
2.3.4. Một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng hình thành AGIs bằng A.oryzae T6 53
2.3.4.1. Ảnh hưởng của nguồn cơ chất môi trường lên men đến khả năng hình thành
AGIs bằng A.oryzae T6 53
2.3.4.2. Ảnh hưởng của thành phần tỷ lệ cám gạo bổ sung vào môi trường lên men đến
khả năng hình thành AGIs bằng A.oryzae T6 53
2.3.4.3. Ảnh hưởng của thành phần K 2 HPO 4 ; KCL và MgSO 4 bổ sung vào môi trường
lên men đến khả năng hình thành AGIs bằng A.oryzae T6 . 53
2.3.4.4. Ảnh hưởng pH ban đầu của môi trường lên men đến khả năng hình thành AGIs
bằng A.oryzae T6 . 54
2.3.4.5. Ảnh hưởng độ ẩm ban đầu của môi trường lên men đến khả năng hình thành
AGIs bằng A.oryzae T6 54
2.3.4.6. Ảnh hưởng độ đầy khối môi trường lên men đến khả năng hình thành AGIs
bằng A.oryzae T6 . 54
2.3.4.7. Ảnh hưởng của lượng giống ban đầu lên men đến khả năng hình thành AGIs
bằng A.oryzae T6 . 54
2.3.4.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến khả năng hình thành AGIs bằng A.oryzae
T6 . 55
2.3.4.9. Sự biến động AGIs trong quá trình lên men bằng A.oryzae T6 55
2.3.5. Chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men bằng sử dụng sóng siêu âm . 55
2.3.5.1. Ảnh hưởng của dung môi đến khả năng chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men 55
2.3.5.2. Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến khả năng chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên
men 55
2.3.5.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi ethanol và đỗ đen lên men đến khả năng chiết
xuất AGIs . 56
2.3.5.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên
men: . 56
2.3.5.5. Ảnh hưởng của thời gian và cường độ sóng siêu âm đến khả năng chiết xuất
AGIs từ đỗ đen lên men . 56
2.3.6. Tinh sạch và định lượng AGIs từ đỗ đen lên men . 56
2.3.6.1. Khảo sát dung môi cho tinh sạch sơ bộ AGIs . 56
2.3.6.2. Khảo sát nồng độ ethanol cho tinh sạch sơ bộ AGIs 57
2.3.6.3. Thu nhận AGIs 57
2.3.6.4. Tinh sạch AGIs bằng RP - HPLC . 57
2.3.6.5. Xác định khối lượng phân tử và trình tự amino acid của AGIs bằng khối phổ 57
2.3.6.6. Định lượng peptide AGIs bằng RP - HPLC . 58
2.3.7. Ứng dụng AGIs . 58
2.3.7.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ cô, sấy tạo chế phẩm đến chất lượng chế phẩm AGIs 59
2.3.7.2. Đánh giá chỉ tiêu chất lượng, cảm quan và an toàn thực phẩm của chế phẩm
AGIs . 59
2.3.7.3. Thử nghiệm ứng dụng chế phẩm AGIs để tạo bột uống liền AGIs . 60
Với A: là T3; 61
2.3.8. Đề xuất công nghệ sản xuất chế phẩm AGIs từ đỗ đen xanh lòng lên men bằng
A.oryzae T6 62
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 63
3.1. Tuyển chọn A.oryzae có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao . 63
3.1.1. Phân lập Aspergillus oryzae 63
3.1.2. Tuyển chọn chủng nấm có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao . 64
3.1.3. Định danh chủng tuyển chọn được dựa trên so sánh trình tự gen vùng ITS1- 5,8S
- ITS2 . 66
3.2. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng của A.oryzae T6 trong nhân giống trên
môi trường rắn . 68
3.2.1. Ảnh hưởng của thành phần cơ chất môi trường rắn đến sinh trưởng của A.oryzae
T6 . 68



3.2.2. Ảnh hưởng của thành phần tỷ lệ trấu trong môi trường rắn đến sinh trưởng của
A.oryzae T6 70
3.2.3. Ảnh hưởng độ ẩm ban đầu của môi trường nhân giống đến sinh trưởng của
A.oryzae T6 71
3.2.4. Ảnh hưởng pH ban đầu của môi trường nhân giống đến sinh trưởng của A.oryzae
T6 . 72
3.2.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ nhân giống đến sinh trưởng của A.oryzae T6 73
3.2.6. Ảnh hưởng của độ dày khối môi trường nhân giống đến sinh trưởng của A.oryzae
T6 . 74
3.2.7. Ảnh hưởng của thời gian nhân giống đến sinh trưởng của A.oryzae T6 . 76
3.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng hình thành AGIs bằng A.oryzae T6 . 77
3.3.1. Ảnh hưởng của nguồn cơ chất môi trường lên men đến khả năng hình thành AGIs
bằng A.oryzae T6 . 77
3.3.2. Ảnh hưởng của thành phần tỷ lệ cám gạo bổ sung vào môi trường lên men đến
khả năng hình thành AGIs bằng A.oryzae T6 79
3.3.3. Ảnh hưởng của thành phần K 2 HPO 4 , KCL và MgSO 4 bổ sung vào môi trường lên
men đến khả năng hình thành AGIs bằng A.oryzae T6 . 80
3.3.4. Ảnh hưởng pH ban đầu của môi trường lên men đến khả năng hình thành AGIs
bằng A.oryzae T6 . 82
3.3.5. Ảnh hưởng độ ẩm ban đầu của môi trường lên men đến khả năng hình thành
AGIs bằng A.oryzae T6 . 83
3.3.6. Ảnh hưởng độ đầy khối môi trường lên men đến khả năng hình thành AGIs bằng
A.oryzae T6 84
3.3.7. Ảnh hưởng của lượng giống ban đầu lên men đến khả năng hình thành AGIs
bằng A.oryzae T6 . 86
3.3.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến khả năng hình thành AGIs bằng A.oryzae
T6 . 87
3.3.9. Sự biến động AGIs trong quá trình lên men bề mặt trên môi trường rắn bằng
A.oryzae T6 88
3.4. Chiết xuất AGIs từ đỗ đen xanh lòng lên men bằng A.oryzae T6 (đỗ đen lên men)
bằng sử dụng sóng siêu âm 90
3.4.1. Ảnh hưởng của dung môi đến khả năng chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men 90
3.4.2. Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến khả năng chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men . 91
3.4.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi ethanol và đỗ đen lên men đến khả năng chiết xuất
AGIs 93
3.4.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men 95
3.4.5. Ảnh hưởng của thời gian và cường độ sóng siêu âm đến khả năng chiết xuất
AGIs từ đỗ đen lên men . 97
3.5. Tinh sạch và định lượng AGIs từ đỗ đen lên men 103
3.5.1 Khảo sát dung môi để tinh sạch sơ bộ AGIs 103
3.5.2. Khảo sát nồng độ ethanol để tinh sạch sơ bộ AGIs . 104
3.5.3. Tinh sạch AGIs 105
3.5.4. Xác định khối lượng phân tử và trình tự axit amin của peptide AGIs từ đỗ đen lên
men bằng khối phổ 108
3.5.5. Định lượng peptide AGIs của đỗ đen lên men bằng A.oryzae T6 . 109 3.6. Ứng dụng AGIs 110
3.6.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ cô sấy tạo chế phẩm đến chất lượng chế phẩm AGIs 110
3.6.2. Đánh giá chỉ tiêu chất lượng, cảm quan và an toàn thực phẩm của chế phẩm AGIs 111
3.6.7. Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm AGIs cho sản xuất thử nghiệm bột uống liền
AGIs cho người bệnh ĐTĐ . 115
3.6.7.1. Xác định hàm lượng chế phẩm AGIs cho bột uống liền . 115
3.6.7.2. Xác định cơ chất phù hợp phối chế với chế phẩm AGIs cho công thức tạo sản
phẩm bột uống liền 115
3.6.7.3. Xác định công thức tạo sản phẩm bột uống liền 117
Chương 4: ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM AGIs
TỪ ĐỖ ĐEN XANH LÒNG LÊN MEN BẰNG A.ORYZAE T6 . 119
Chương 5: KẾT LUẬN . 122
KIẾN NGHỊ VỀ NHỮNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO 123
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN . 124
TÀI LIỆU THAM KHẢO . 125
PHỤ LỤC . 141