Luận Văn Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme glucose oxidase ngoại bào thô từ nấm mốc Aspergillus niger

LỜI MỞ ĐẦU

Trong vài thập kỷ trở lại đây, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, các chế phẩm enzyme được sản xuất ngày càng nhiều và được sử dụng hầu hết trong các lĩnh vực kinh tế. Enzyme đã dần từng bước làm thay đổi và nâng cao một số các quá trình công nghệ trong chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng của xã hội.
Enzyme glucose oxidase (GOD: β-D-glucosexygen 1-oxidoreductase, EC 1.1.3.4) là enzyme xúc tác quá trình oxi hóa của β-D-glucose thành axit gluconic với sự tham gia của phân tử oxi như chất nhận điện tử, đồng thời giải phóng ra hydroperoxide (H2O2). GOD được biết đến từ những năm 1950, ngày nay được ứng dụng nhiều trong công nghiệp thực phẩm và các lĩnh vực khác như: y dược, hóa học lâm sàng, công nghệ sinh học, trong công nghiệp dệt [10].
Hiện nay, trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu nhằm mục đích thu nhận và ứng dụng GOD vào thực tế sản xuất nhưng ở nước ta thì việc nghiên cứu này còn rất hạn chế và chưa thể sản xuất được chế phẩm GOD. Và đây đang là vấn đề thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học trong và ngoài nước, nắm bắt tình hình đó tôi đã chọn đề tài: “Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme glucose oxidase ngoại bào thô từ nấm mốc Aspergillus niger”.

Mục đích của đề tài:
- Xác định đơn biến ảnh hưởng của nồng độ các nguồn dinh dưỡng carbon, nitơ và muối canxi cacbonat trong môi trường nuôi cấy, để khả năng sinh tổng hợp enzyme GOD ngoại bào từ nấm mốc Aspergillus niger là cao nhất.
- Xác định nồng độ muối (NH4)2SO4 và pH của môi trường nghiên cứu để hiệu suất thu nhận chế phẩm enzyme GOD ngoại bào thô là tốt nhất.
- Thu nhận chế phẩm enzyme ngoại bào thô.


Nội dung nghiên cứu của đề tài:
- Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của saccharose, peptone và CaCO3 đến quá trình sinh tổng hợp enzyme GOD ngoại bào từ nấm mốc Aspergilus Niger.
- Sử dụng phương pháp đo độ hấp thụ quang phổ để đánh giá hoạt lực của enzyme GOD ngoại bào.
- Khảo sát nồng độ bão hòa của muối (NH4)2SO4 và sự ảnh hưởng của pH của MTNC đến khả năng kết tủa enzyme GOD ngoại bào.
- Thu nhận và xác định hoạt độ riêng của chế phẩm enzyme thô.
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài:
- Đóng góp dẫn liệu nghiên cứu điều tra sự ảnh hưởng của một số nguồn dinh dinh dưỡng, tạo tiền đề cho quá trình tối ưu hóa môi trường nuôi cấy cho quá trình sinh tổng hợp enzyme GOD ngoại bào từ nấm mốc Aspergillus niger,
- Kiểm định và khả năng sinh tổng hợp enzyme GOD ngoại từ nấm mốc Aspergillus niger,
- Lựa chọn được điều kiện thích hợp cho khả năng kết tủa enzyme GOD ngoại bào. Tạo tiền đề bước đầu xây dựng quy trình thu nhận chế phẩm enzyme GOD tinh khiết.
Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu chung về nấm mốc
Nấm mốc là vi sinh vật chân hạch, ở thể tản, tế bào không có diệp lục tố, sống dị dưỡng (hoại sinh, ký sinh, cộng sinh), vách tế bào cấu tạo chủ yếu là chitin, có hay không có cellulose và một số thành phần khác có hàm lượng thấp. Theo Elizabeth Tootyll (1984) nấm mốc có khoảng 5.100 giống và 50.000 loài được mô tả, tuy nhiên, ước tính có trên 100.000 đến 250.000 loài nấm hiện diện trên trái đất [23] .
1.1.1. Hình dạng, kích thước, cấu tạo của nấm mốc [23]
Một số ít nấm ở thể đơn bào có hình trứng, đa số có hình sợi, sợi có ngăn vách (đa bào) hay không có ngăn vách (đơn bào). Sợi nấm thường là một ống hình trụ dài có kích thước lớn nhỏ khác nhau tùy loài. Đường kính của sợi nấm thường từ 3ư5 µm, có khi đến 10 µm, thậm chí đến 1 mm. Chiều dài của sợi nấm có thể tới vài chục centimet. Các sợi nấm phát triển chiều dài theo kiểu tăng trưởng ở ngọn. Các sợi nấm có thể phân nhánh và các nhánh có thể lại phân nhánh liên tiếp tạo thành hệ sợi nấm khí sinh xù xì như bông. Trên môi trường đặc và trên một số cơ chất trong tự nhiên, bào tử nấm, tế bào nấm hoặc một đoạn sợi nấm có thể phát triển thành một hệ sợi nấm có hình dạng nhất định gọi là khuẩn lạc nấm.


Tế bào nấm có cấu trúc tương tự như những tế bào vi sinh vật chân hạch khác. Vách tế bào nấm cấu tạo bởi vi sợi chitin và có hoặc không có cellulose. Chitin là thành phần chính của vách tế bào ở hầu hết các loài nấm trừ nhóm Oomycetina. Những vi sợi chitin được hình thành nhờ vào enzyme chitinsyntase. Tế bào chất của tế bào nấm mốc chứa mạng nội mạc, không bào, ty thể và hạt dự trữ, đặc biệt cấu trúc ty thể ở tế bào nấm tương tự như cấu trúc ty thể ở tế bào thực vật. Ngoài ra, tế bào nấm còn có ribose thể và những thể khác chưa rõ chức năng. Tế bào nấm không có diệp lục tố, một vài loài nấm có rải rác trong tế bào một loại sắc tố đặc trưng mà Matsueda và cộng sự (1978) đầu tiên trích ly được và gọi là neocercosporin (C29H26O10) có màu tím đỏ ở nấm Cercosporina kikuchi. Tế bào nấm không nhất thiết có một nhân mà thường có nhiều nhân. Nhân của tế bào nấm có hình cầu hay bầu dục với màng đôi phospholipid và protein, bên trong màng nhân chứa ARN và ADN.

1.3.5.2. Các thông số ảnh hưởng đến quá trình sản xuất enzyme [20]
1. Nguồn carbon
Trong suốt quá trình lên men, nguồn cacbon không chỉ đóng vai trò như thành phần chính để xây dựng vật liệu tế bào mà còn được sử dụng trong quá trình tổng hợp polysaccharide và đóng vai trò là nguồn cung cấp năng lượng cho tế bào. Tỷ lệ cacbon được chuyển hóa có thể ảnh hưởng đến sự hình thành sinh khối hay sản phẩm chuyển hóa (chính hoặc phụ). Lượng đường chuyển hóa càng nhanh sẽ giúp tế tào phát triển càng nhanh, kết hợp với sự tạo thành lượng lớn các sản phẩm liên quan hay các chất chuyển hóa chính.
Năm 1995, Hatzinikolaou và Macris đã nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn cacbon khác nhau đến sự phát triển và sinh tổng hợp GOD của A. niger. Mặc dù nấm mốc A. niger phát triển trên tất cả các nguồn cacbon mà họ đã kiểm tra, nhưng enzyme GOD chỉ thể hiện hoạt tính cao khi sử dụng các nguồn glucose, saccharose và rỉ đường. Hơn nữa, glucose (ở dạng tinh khiết hoặc là sản phẩm thuỷ phân saccharose bởi invertase) là tác nhân cảm ứng chính cho sự phiên mã gen của enzyme GOD. Năm 2001, Kona đã sử dụng saccharose như nguồn cacbon chính khi sử dụng nguồn dinh dưỡng thương mại có chứa nước ngâm bắp để thực hiện lên men cho A. niger. Năm 1960, Kusai nhận thấy saccharose là nguồn carbon tốt nhất cho P. amagasakiense sản xuất GOD. Dù sao, nếu pH của môi trường phát triển được duy trì trong suốt quá trình nuôi thì glucose là nguồn cacbon được lựa chọn.
2. Nguồn nitơ
Nitơ vô cơ bao gồm khí amoniac, muối amoni hoặc nitrate. Amoniac được sử dụng để điều chỉnh pH. Muối amoni như amoni sulphate thường tạo môi trường axit khi vi sinh vật sử sụng ion NH4+ và giải phóng ra axit tự do. Mặt khác, nitrate thường gây ra khuynh hướng kiềm hoá khi chúng được chuyển hóa. Amoni nitrate trước hết sẽ gây ra khuynh hướng axit khi ion amoni được sử dụng. Khi các ion amoni cạn kiệt, nitrat sẽ được sử dụng như nguồn nitơ thay thế và tạo ra môi trường kiềm. Năm 1995, Hatzinikolaou và Macris nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn nitơ khác nhau đến sự phát triển và hoạt tính tổng của GOD từ A. niger nuôi trên nguồn carbon duy nhất là saccharose và rỉ đường. Họ nhận thấy nồng độ peptone có ảnh hưởng rõ ràng đến toàn bộ quá trình sản xuất GOD. Với saccharose và rỉ đường làm nguồn cacbon, hoạt tính cực đại của GOD đạt được lần lượt tại 1ư2% và 0.2ư0.3% peptone. Năm 2001, Kona khảo sát ảnh hưởng của nước ngâm bắp là nguồn dinh dưỡng duy nhất cho sản xuất GOD từ A. niger và nhận thấy hoạt tính của GOD tăng lên từ 550 Umlư 1 đến 640 Umlư 1, trong khi đó các nguồn nitơ khác không thể cải thiện thêm khả năng tổng hợp GOD