Thạc Sĩ Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme cellulase kỹ thuật từ xạ khuẩn và ứng dụng sản xuất thử nghiệm b

Luận văn thạc sĩ năm 2012
Đề tài: NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHẾ PHẨM ENZYME CELLULASE KỸ THUẬT TỪ XẠ KHUẨN VÀ ỨNG DỤNG SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM BỘT RONG THỰC PHẨM


MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN . i
LỜI CAM ĐOAN . ii
MỤC LỤC iii
DANH MỤC HÌNH vii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .x
MỞ ĐẦU 1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
1.1. Giới thiệu về xạ khuẩn 4
1.1.1. Phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên 4
1.1.2. Cấu tạo và đặc điểm hình thái của xạ khuẩn .5
1.1.3. Ý nghĩa thực tiễn của xạ khuẩn 7
1.1.4. Hệ thống và đặc điểm phân loại xạ khuẩn chi Micromonospora .8
1.2. Tổng quan enzyme cellulase .10
1.2.1. Cơ chất của enzyme cellulase 10
1.2.2. Phức hệ enzyme cellulase phân cắt cellulose 15
1.2.3. Ảnh hưởng của điều kiện môi trường đến khả năng sinh tổng hợp enzyme
cellulase 24
1.3. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng enzyme cellulase 29
1.3.1. Lược sử nghiên cứu cellulase trên thế giới và trong nước 29
1.3.2. Các lĩnh vực ứng dụng cellulase 32
1.4. Rong Mứt 36
1.4.1. Giới thiệu chung 36
1.4.2. Hệ thống và đặc điểm phân loại rong Mứt .36
1.4.3. Tình hình chế biến và sử dụng thực phẩm được từ rong biển tại Việt Nam .39
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 43
2.1. Đối tượng và hóa chất .43
2.1.1. Đối tượng 43
2.1.2. Hóa chất và thiết bị chuyên dụng .44
ương nghiên cứu Trang iv
iv
2.2. Phương pháp nghiên cứu .48
2.2.1. Phương pháp hóa sinh 48
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu vi sinh vật 49
2.2.3. Phương pháp đánh giá phân tích 50
2.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm 51
2.3.1. Sơ đồ nội dung nghiên cứu chính .51
2.3.2. Bố trí thí nghiệm lựa chọn chủng xạ khuẩn và môi trường thích hợp sinh
tổng hợp enzyme cellulase .51
2.3.3. Bố trí thí nghiệm xác định thành phần môi trường và điều kiện nuôi sinh
enzyme 54
2.4. Bố trí thí nghiệm thu nhận C-CPE từ dịch nuôi cấy .57
2.4.1. Lựa chọn tác nhân kết tủa 57
2.4.2. Lựa chọn nồng độ kết tủa .58
2.4.3. Xác định tính chất lý hóa của C-CPE 58
2.5. Thử nghiệm sản xuất bột rong thủy phân từ rong Mứt Porphyra vietnamensis 59
2.6. Phương pháp xử lý số liệu 64
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .65
3.1. Nghiên cứu tuyển chọn chủng có khả năng sinh tổng hợp enzyme cao 65
3.1.1. Kết quả nghiên cứu lựa chọn chủng và môi trường lên men thích hợp 65
3.1.2. Nghiên cứu chủng xạ khuẩn Micromonospora VTCC-A-1787 67
3.2. Xác định các điều kiện môi trường tối ưu sinh tổng hợp cellulase của chủng
MicromonosporaVTCC-A-1787 72
3.2.1. Kết quả nghiên cứu khả năng sinh enzyme cellulase theo thời gian .72
3.2.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ cơ chất cảm ứng 74
3.2.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn và nồng độ nguồn carbon .76
3.2.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn và nồng độ nitrogen .79
3.2.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy 82
3.2.6. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng pH môi trường nuôi cấy ban đầu .83
3.2.7. Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy sinh tổng hợp enzyme celluase có hoạt tính
cao nhất theo quy hoạch Box – Behnken. 85
ương nghiên cứu Trang v
v
3.3. Nghiên cứu tách chiết và xác định một số đặc tính của cellulase của Micromonospora
VTCC-A-1787 91
3.3.1. Kết quả nghiên cứu xác định tác nhân kết tủa C-DC 91
3.3.2. Kết quả nghiên cứu xác định nồng độ tác nhân kết tủa .93
3.3.3. Nghiên cứu tính chất lý hóa của C-CPE cellulase .94
3.4. Đề xuất quy trình thu chế phẩm enzyme cellulase kỹ thuật từ chủng xạ
khuẩn chi Micromonospora VTCC-A-1787 .95
3.5. Nghiên cứu sản xuất bột rong thực phẩm .96
3.5.1. Kết quả nghiên cứu xác định các thành phần chủ yếu trong rong Mứt
Porphyra Vietnamensis 97
3.5.2. Kết quả nghiên cứu sử dụng C-CPE của chủng MicromonosporaVTCC-A-1787 trong quá trình thủy phân 98
3.5.3. Kết quả đánh giá chỉ tiêu chất lượng bột rong 98
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .101
Kết luận .101
Kiến nghị 101
TÀI LIỆU THAM KHẢO .102
PHỤ LỤC .106
Phụ lục 1. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ PHÂN TÍCH 106
Phụ lục 2. BẢNG KẾT QUẢ CÁC THÍ NGHIỆM 111
Phụ lục 3. MỘT SỐ DỤNG CỤ, THIẾT BỊ SỬ DỤNG 114
Phụ lục 4. MỘT SỐ HÌNH ẢNH THÍ NGHIỆM .116


MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Dưới góc độ y học, rong biển là nguồn thực phẩm tự nhiên quý giá giàu
chất dinh dưỡng, có tác dụng đến sức khỏe và sự ổn định của cơ thể con người.
Hiện nay, nhu cầu sử dụng rong biển làm thực phẩm trên thế giới ngày càng tăng
và phổ biến. Tuy nhiên vấn đề khai thác và chế biến rong biển ở Việt Nam còn
nhiều mới mẻ và hạn chế, không sử dụng hết sản lượng cũng như hiệu quả lợi ích
mà rong đem lại. Hơn nữa, các sản phẩm từ rong biển ở nước ta chưa nhiều, chưa
thực sự được chú ý và phổ biến, rất ít người dân biết đến loại thực phẩm đặc biệt
này, đây đang là một vấn đề còn đang bỏ ngỏ [21].
Ngoài các thành phần dinh dưỡng cơ bản và hàm lượng acid amin quan
trọng vốn có, rong biển còn chứa lượng cel lớn mà cơ thể con người không có
khả năng tiêu hóa. Cel là một thành phần quan trọng cấu tạo nên lớp thành tế
bào thực vật, là một loại polysaccharide có cấu trúc phức tạp. Việc phân hủy cel
bằng các tác nhân lý hóa (acid, bazơ mạnh) gặp nhiều khó khăn, làm ảnh hưởng
đến tốc độ của nhiều quá trình sản xuất công nghiệp và không được khuyến khích
trong chế biến thực phẩm ngày nay. Chính vì vậy mà yêu cầu đặt ra là phải thay
thế bằng các phương pháp an toàn hơn.
Để giải quyết vấn đề này, chúng tôi nhận thấy có thể ứng dụng các chế
phẩm vi sinh vật có hoạt tính cellulase tác động một cách đặc hiệu lên cơ chất
cel, đây là loại enzyme hiện nay đang được rất nhiều nhà khoa học quan tâm.
Cellulase là một phức hợp enzyme bao gồm 3 loại enzyme thủy phân cel. Các
enzyme này kết hợp với nhau và tham gia phân cắt ngẫu nhiên các liên kết β-1,4
glucoside từ bên trong phân tử cel và một số loại polysaccharide tương tự khác
tạo thành glucose và một số đường chức năng như Oligossacharide. Các nghiên
cứu về Oligossacharide trong thực phẩm và dinh dưỡng đang là vấn đề quan tâm
của các nhà khoa học trên thế giới. Đây là nhóm thực phẩm có giá trị dinh dưỡng
và mức năng lượng thấp, nhưng lại chứa các hoạt chất cải thiện chất lượng sản
phẩm và tăng cường sức khỏe con người [42, 39].
ương nghiên cứu Trang 2
2
Cellulase được sinh tổng hợp từ rất nhiều nguồn khác nhau như thực vật,
động vật và chủ yếu vẫn là từ VSV như vi khuẩn (Pseudomonas fluorescens,
Cllulosemanas), nấm (Trichoderma viride, Aspergillus niger) và xạ khuẩn
(Actinomycetes). Trong những năm gần đây, nhóm XK đang được các nhà sinh
vật thế giới quan tâm nghiên cứu dùng để sản xuất kháng sinh và enzyme gồm 2
chi là Streptomyces và Micromonospora. Việc hướng đến sử dụng chế phẩm từ
VSV trong sản xuất thực phẩm ngày nay ngày càng rộng rãi, đây là một hướng đi
mới tất yếu và hiệu quả trong điều kiện các ngành sản xuất truyền thống bằng
phương pháp hóa học đang gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng [17].
Trong sản xuất và đời sống, enzyme nói chung và cellulase nói riêng được
sử dụng ngày càng phổ biến, sản lượng và kim ngạch mua bán các chế phẩm
enzyme trên thị trường thế giới tăng 20ư30% mỗi năm. Enzyme và những chế
phẩm có liên quan được sử dụng trong các ngành công nghiệp nhẹ, nông nghiệp,
công nghiệp thực phẩm ở Việt Nam hiện nay chủ yếu được nhập khẩu từ nước
ngoài với giá thành cao mặc dù nước ta có nguồn phế phẩm nông nghiệp dùng
làm nguyên liệu để sản xuất enzyme cellulase là rất phong phú, dễ kiếm, rẻ tiền
như: mạt cưa, mùn gỗ, mạt dừa, rơm. Bên cạnh đó, ở Việt Nam nhóm XK chi
Micromonospora được nghiên cứu từ những năm 90 nhưng kết quả còn rất hạn
chế. Do đó, với mong muốn được tiếp tục tìm hiểu về đặc tính phân loại và khả
năng sinh tổng hợp enzyme của nhóm XK chi Micromonospora, góp phần
nghiên cứu sản xuất các chế phẩm enzyme hoạt tính cao có nguồn gốc tự nhiên,
tiếp tục nghiên cứu để sản xuất được cellulase có giá thành rẻ đáp ứng nhu cầu
thị trường và các loại thực phẩm có các thành phần chứa hoạt tính sinh học nhằm
gia tăng giá trị rong biển Việt Nam, đề tài: “Nghiên cứu thu nhận chế phẩm
enzyme cellulase kỹ thuật từ xạ khuẩn và ứng dụng sản xuất thử nghiệm bột
rong thực phẩm” là cần thiết.
2. Mục đích nghiên cứu của đề tài
Thăm dò các điều kiện thích hợp để khai thác và thu nhận dịch chiết và
chế phẩm enzyme kỹ thuật từ XK chi Micromonospora.Sau đó sử dụng C-CPE
này thủy phân rong Porphyra Việt Nam để sản xuất bột rong thực phẩm.
ương nghiên cứu Trang 3
3
3. Nội dung nghiên cứu của đề tài
- Nghiên cứu lựa chọn chủng xạ khuẩn Micromonospora thích hợp và
nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp
enzyme cellulase có hoạt tính cao.
- Nghiên cứu phương pháp thích hợp để thu nhận dịch chiết và chế phẩm
enzyme kỹ thuật ở quy mô phòng thí nghiệm.
- Bước đầu nghiên cứu ứng dụng chế phẩm enzyme trên thủy phân rong
mứt sản xuất bột rong thực phẩm và đánh giá chất lượng của bột rong này.
4. Ý nghĩa khoa học của đề tài
- Kết quả nghiên cứu của luận văn góp phần thêm những hiểu biết về đặc
tính enzyme cellulase sản xuất từ XK được phân lập tại Việt Nam và ứng dụng
của enzyme này trong chế biến thực phẩm.
- Tạo ra dẫn liệu khoa học có giá trị tham khảo cho sinh viên và cán bộ kỹ
thuật, bổ sung vào các tài liệu phục vụ cho giảng dạy ngành Công nghệ Thực
phẩm, ngành Công nghệ sinh học.
5. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
Bước đầu nghiên cứu sử dụng enzyme chiết rút từ XK Micromonospora
để thủy phân rong biển và thu chế phẩm là bột rong. Kết quả thu được là cơ sở để
đánh giá hiệu quả và khả năng ứng dụng của enzyme cellulase VSV. Từ đó cải
thiện, nâng cao chất lượng và góp phần tìm ra hướng giải quyết mới mang lại
hiệu quả kinh tế cho enzyme sản xuất từ VSV Việt Nam và cho rong biển Việt
Nam.
ương nghiên cứu Trang 4
4
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về xạ khuẩn
1.1.1. Phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên
Xạ khuẩn (Actinobacteria) hay còn gọi là nấm tia, theo từ cổ Hy Lạp
“Acti” có nghĩa là tia, thuộc nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố rất rộng rãi
trong tự nhiên. Chúng có trong đất, nước, rác, phân chuồng, bùn, thậm chí cả
trong cơ chất mà vi khuẩn và nấm mốc không phát triển được.
Theo Agre và một số tác giả khác (1969) thì sự phân bố của xạ khuẩn phụ
thuộc vào khí hậu, thành phần đất, mức độ canh tác và thảm thực vật. Ngay từ
những năm đầu của thế kỷ XX, Mike đã phân lập được các chủng XK ưa nhiệt
thuần khiết trong quá trình phân hủy rác, bã, rơm rạ, cỏ khô. Rabinowitch (1895)
và Tsiklinsky (1903) đã phân lập được xạ khuẩn ưa nhiệt từ phân. Năm 1912,
Noack phân lập được chúng từ cỏ khô. Năm 1912, Gilbert cũng đã phân lập được
XK ưa nhiệt từ nhiều cơ chất khác nhau như không khí, cát, sa mạc, than bùn,
đặc biệt là trong ruột người và nước cống thải. Tendler (1959) và Burkholder
(1960) đã phân lập được hơn 100 chủng XK ưa nhiệt thuộc 2 giống
Thermomonosprora và Streptomyces từ các mẫu đất khác nhau của các nước Mỹ,
Pháp, Tây Ban Nha, Ý, Pêru, Chilê. Kosmather (1953, 1962) đã phân lập được
nhiều chủng XK ưa nhiệt từ các vùng Liên Xô cũ như miền Bắc, miền Tây, các
vùng núi cao như Capcazơ, Palmia
Waksman (1959) khi phân lập và tuyển chọn XK ưa nhiệt đã cho thấy
chúng hầu như có mặt trong tất cả các loại đất và ở các mùa trong năm. Ngay ở
vùng ôn đới nhiều loại đất cũng thường có 10.000ư15.000 mầm XK trong 1 gam
đất khô. Vào mùa đông số lượng XK ưa nhiệt chỉ chiếm khoảng 10ư15% so với
tổng vsv ưa nhiệt, nhưng đến mùa hè thì số lượng chúng tăng lên đến 70ư90%.
Theo Waksman thì trong một gam đất có khoảng 29.000ư2.400.000 mầm XK,
chiếm 9ư45% tổng số VSV [45].
Sự phân bố của XK còn phụ thuộc nhiều vào nhiệt độ, độ pH môi trường.
XK được chia làm 2 loại là ưa ấm, phát triển và sinh trưởng ở nhiệt độ từ
25ư45
o
C và ưa nhiệt từ 50ư70
o
C, chúng có nhiều trong các lớp đất trung tính và


TÀI LIỆU THAM KHẢO
A. TIẾNG VIỆT
1. Kiều Hữu Ảnh (1999), Giáo trình Vi sinh vật học công nghiệp, NXB
Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.
2. Lý Kim Bảng, Lê Gia Hy, Tăng Thị Chính, Phan Tuyết Minh, Lê
Thanh Xuân, Trần Quang Huy, Đào Ngọc Quang, Phạm Thị Cúc (1999),
Sử dụng vi sinh vật có hoạt tính phân giải cellulose cao để nâng cao chất lượng
phân hủy rác thải sinh hoạt và nông nghiệp. Báo cáo khoa học, Hội nghị Công
nghệ Sinh học toàn quốc, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội: 546-551.
3. Vũ Thị Thanh Bình (1992), Nghiên cứu xạ khuẩn ưa nhiệt phân giải
cellulose và khả năng ứng dụng trong chăn nuôi, Luận án PTS Khoa học Sinh
học, ĐH Sư Phạm Hà Nội.
4. Nguyễn Trọng Cẩn, Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến
(1998), Công nghệ enzyme, Nhà xuất bản Nông Nghiệp, TP.HCM.
5. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đăng Đức, Đặng Hồng Miên, Nguyễn
Vĩnh Phước, Nguyễn Đình Quyến, Nguyễn Phùng Tiến, Phạm Văn Ty (1976),
Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật - Tập 2 và 3, NXB Khoa học và Kỹ
thuật, Hà Nội.
6. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2002), Vi sinh
vật học, Nhà xuất bản Giáo Dục, Hà Nội.
7. Đặng Văn Giáp (1997), Phân tích dữ liệu khoa học bằng chương trình
M-S Excel, NXB Giáo Dục.
8. Bùi Thị Việt Hà (2006), Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống
nấm gây bệnh thực vật ở Việt Nam", Luận án tiến sĩ sinh học, Hà Nội.
9. Phan Hiếu Hiền (2001), Phương pháp bố trí thí nghiệm và xử lý số liệu,
NXB Nông Nghiệp.
10. Phạm Thị Ánh Hồng (2003), Kỹ Thuật Sinh Hóa, Trường Đại Học Khoa
Học Tự Nhiên, Nhà xuất bản ĐHQG TP.HCM.
ương nghiên cứu Trang 103
103
11. Phạm Thị Ngọc Lan (1996), Tìm hiểu khả năng phân giải các phế phụ
phẩm cellulose của vi sinh vật,Báo cáo khoa học tại Hội thảo về quản lý tài
nguyên và bảo vệ môi trường ở Bình Trị Thiên, Huế.
12. Phạm Thị Ngọc Lan, Phạm Thị Hòa, Lý Kim Bảng (1999), Tuyển chọn
một số chủng xạ khuẩn có khả năng phân giải cellulose từ mùn rác, Báo cáo
khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, NXB Khoa học và Kỹ
thuật, Hà Nội: 177-182.
13. Nguyễn Đức Lượng, Đặng Vũ Bích Hạnh (1999), Khả năng sinh tổng
hợp cellulase của Actinomyces griseus, Báo cáo khoa học, Hội nghị
Công nghệ Sinh học toàn quốc, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.
14. Đỗ Văn Nam (2004), Nghiên cứu, đánh giá hiện trạng môi trường các
cơ sở chế biến agar, đề xuất các biện pháp quản lý,BCKH - Viện nghiên cứu
Hải sản, Hải Phòng.
15. Trần Xuân Ngạch (2007), Công nghệ enzyme, Trường Đại Học Bách
Khoa Đà Nẵng.
16. Võ Hồng Nhân, Trần Tiến Đức (4/1993), Thủy phân vỏ chuối bằng
Cellulase, Tạp chí KHCN, Tập 31.
17. Lê Văn Nhương, Đặng Hanh Khôi, Hoàng Tuyền Minh (1978),Thu
nhận và ứng dụng các chất hoạt động từ vi sinh vật, NXB Khoa học và Kỹ thuật
Hà Nội.
18. Nguyễn Đức Lượng (1996), Nghiên cứu tính chất của một số vi sinh vật
có khả năng tổng hợp cellulase cao và ứng dụng trong công nghệ xử lý chất thải
hữu cơ,Luận văn tiến sĩ khoa học, trường ĐHKHTN Hà Nội.
19. Nguyễn Đức Lượng (2003), Thí nghiệm vi sinh vật học– Tập II, Đại học
Quốc Gia, TP.HCM.
20. Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết (2003), Thí
nghiệm Công nghệ Sinh học,NXB Đại học Quốc gia, TP.HCM.
21. Trần Thị Luyến, Đỗ Minh Phụng, Nguyễn Anh Tuấn, Ngô Đăng
Nghĩa (2004), Chế biến rong biển, Nhà Xuất Bản Nông Nghiệp, TP.HCM.
22. Lương Đức Phẩm (2004), Công nghệ vi sinh vật, Nhà xuất bản Nông
nghiệp, Hà Nội.
ương nghiên cứu Trang 104
104
23. Lê Xuân Phương (2001), Vi sinh vật học công nghiệp, Nhà xuất bản Xây
Dựng, Hà Nội.
24. Trần Linh Thước (2007), Phương pháp phân tích vi sinh vật trong
nước, thực phẩm và mỹ phẩm,Nhà xuất bản Giáo Dục.
25. Hồ Sỹ Tráng (2006), Cơ sở hóa gỗ và cellolose - Tập 2, NXB Khoa học
và Kỹ thuật.
26. Nguyễn Đình Quyến và cộng sự (1986), Khả năng phân giải Cellulose
của xạ khuẩn phân lập ở Việt Nam,Tuyển tập công trình nghiên cứu khoa học
của trường ĐH Tổng hợp Hà Nội.
27. Phạm Văn Sổ, Bùi Thị Như Thuận (1991), Kiểm nghiệm lương thực,
thực phẩm, Khoa Hóa học Thực Phẩm, Trường Đại Học Bách Khoa, HN.
28. Trần Cẩm Vân, Bạch Phương Lan (1995), Công nghệ vi sinh và bảo vệ
môi trường, NXB KHKT Hà Nội.
B. TIẾNG ANH
29. Coral G, Arikan B, Unaldi M, Guvenmes H (2002), "Some properties
of crude carboxymethyl cellulase of Aspergillus niger Z10 wild-type Strain",
Turk J Biol, 26: 209-213.
30. Coughlan M.P., Folan M.A (1979), Cellulose and cellulase: food for
throught, food for future, InT.J.Biochem, (10), pp 103-168.
31. Feznandez C. and Sz¸bo. Zs (1982), Isolate and Characteritation of
Micromonospora. Heviziensis sp. nov. Acta. Micrbiol. Acard. Sei. Hung. 29,
115- 122.
32. Gascoigne J. and Gascoigne M.M (1960), Biological degradation of
cellulose,Butterwozch and Co.Limited, London, pp 17-21.
33. Gielkens M, Dekker E, Visser J, Graaff L (1999), "Two
cellubiohydrolase-encoding genes from Aspergillus niger require D-
Xylose and the xylanolytic transcriptional activator XlnR for their
expression", Appl Environ Microbiol, 65(10): 4340-4345.
34. Henning J, Morkeberg A, Krogh KBR, Olsson L (2005), "Production of
cellulases and hemicellulases by three Penicillium species: effect of substrate
and evaluation of cellulase adsorption by capillary electrophoresis",