Thạc Sĩ Nghiên cứu thành phần luận án thạc sĩ: Hóa học và tác dụng chống oxy hóa của một số cây thuốc hướng

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN LUẬN ÁN THẠC SĨ: HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA MỘT SỐ CÂY THUỐC HƯỚNG TÁC DỤNG TRÊN GAN ​MỤC LỤC
Lời cam đoan VII
Danh mục các bảng .X
Danh mục các hình . XII
Danh mục sơ đồ XIV
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 6
1.1. TỔNG QUAN VỀ GỐC TỰ DO VÀ CHẤT CHỐNG OXY HÓA 6
1.1.1. Gốc tự do .6
1.1.1.1. Khái niệm về gốc tự do .6
1.1.1.2. Nguồn gốc phát sinh gốc tự do trong cơ thể 6
1.1.1.3. Vai trò của gốc tự do trong cơ thể .10
1.1.2. Các chất chống oxy hóa .16
1.1.2.1. Chất chống oxy hóa có bản chất enzym 16
1.2.2.2. Chất chống oxy hóa không có bản chất enzym 18
1.2. TỔNG QUAN VỀ GAN VÀ BỆNH LÝ CỦA GAN DO OXY HÓA .23
1.2.1. Cấu trúc gan và các loại tế bào có trong gan .23
1.2.2. Vai trò của các gốc tự do trong phát sinh bệnh trong gan .24
1.2.2.1. Vai trò của gốc tự do trong sự gây tổn thương gan do thiếu máu cục bộ .24
1.2.2.2. Vai trò của gốc tự do trong bệnh gan nhiễm mỡ không do cồn .26
1.2.2.3. Vai trò của gốc tự do trong bệnh xơ hóa gan .28
1.2.2.4. Stress oxy hóa trong bệnh viêm gan siêu vi C 28
1.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC SÀNG LỌC DƯỢC LIỆU CÓ KHẢ NĂNG
CHỐNG OXY HÓA VÀ BẢO VỆ GAN 29
1.3.1. Các phương pháp đánh giá khả năng chống oxy hoá 30
1.3.1.1. Phương pháp phân tích FRAP .30
1.3.1.2. Phương pháp đánh giá khả năng loại gốc tự do DPPHã 31
1.3.1.3. Phương pháp đo MDA .31
1.3.1.4. Phương pháp đánh giá khả năng antioxidant với hệ thống β-caroten- acid linoleic32
III
1.3.1.5. Phương pháp ức chế enzym xanthin oxidase .33
1.3.2. Phương pháp xác dịnh hoạt tính bảo vệ gan trên gan bị gây độc bởi CCl4 gây
độc tế bào .33
1.3.3. Phương pháp phân tích hoạt tính bảo vệ gan do galactosamin gây độc tế bào
nuôi cấy 34
1.3.4. Phương pháp phân tích hoạt tính bảo vệ gan in vivo 34
1.4. TỔNG QUAN VỀ MỘT SỐ CÂY THUỐC TRỊ BỆNH GAN .34
1.4.1. Râu mèo .36
1.4.2. Chi Polygonum 40
1.4.3. Giới thiệu về cây Cúc gai .44
CHƯƠNG 2 - NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 47
2.1. NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT NGHIÊN CỨU 47
2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu .47
2.1.2. Trang thiết bị 49
2.1.3. Hóa chất .50
2.1.3.1. Hóa chất sử dụng cho nghiên cứu hóa học và chiết xuất .50
2.1.3.2. Hóa chất sử dụng cho thử nghiệm sinh học .50
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 50
2.2.1. Xác định mẫu .50
2.2.2. Nghiên cứu hóa học .51
2.2.2.1. Phương pháp chiết xuất để sàng lọc tác dụng chống oxy hóa .51
2.2.2.2. Sơ bộ khảo sát thành phần hóa học 52
2.2.2.3. Chiết xuất cho nghiên cứu hóa học và sinh học .52
2.2.2.4. Sắc ký lớp mỏng .54
2.2.2.5. Phân tách các phân đoạn và phân lập các hợp chất .54
2.2.3. Nghiên cứu xác định cấu trúc của các chất tinh khiết 54
2.2.4. Các phương pháp sàng lọc khả năng chống oxy hóa .54
2.2.4.1. Phương pháp FRAP 54
2.2.4.2. Phương pháp đo MDA .55
2.2.4.3. Phương pháp sàng lọc khả năng loại gốc tự do DPPH .56
2.2.4.4. Phương pháp xác định khả năng ức chế enzym xanthin oxidase .56
2.2.5. Thử tác dụng sinh học bảo vệ tế bào gan ex vivo .57
IV
2.2.5.1. Quy trình rửa và phân tách tế bào gan 57
2.2.5.2. Phương pháp đếm số lượng tế bào bằng thuốc nhuộm Trypan blue .59
2.2.5.3. Phương pháp đo hoạt độ enzym alanin aminotransferase (ALT/GPT) 59
2.2.5.4. Cách chuẩn bị mẫu và dịch tế bào gan 60
2.2.5.5. Bố trí nhóm thí nghiệm .60
2.2.5.6. Thiết kế thí nghiệm 61
2.2.6. Phương pháp thử tác dụng sinh học trên mô hình in vivo 62
2.2.6.1. Bố trí nhóm thí nghiệm .62
2.2.6.2. Phương pháp tiến hành 62
2.2.6.3. Thiết kế thí nghiệm 63
2.2.7. Thử nghiệm độc tính cấp diễn .63
2.2.8. Phương pháp xử lí số liệu 64
CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 65
3.1. KẾT QUẢ SÀNG LỌC TÁC DỤNG SINH HỌC CHỐNG OXY HÓA IN VITRO
CỦA CÁC DƯỢC LIỆU .65
3.1.1. Chiết xuất các dược liệu thu cho thử nghiệm in vitro 65
3.1.2. Kết quả chống oxy hóa in vitro theo phương pháp FRAP .67
3.1.3. Kết quả chống oxy hóa in vitro theo phương pháp MDA .71
3.1.4. Kết quả chống oxy hóa in vitro theo phương pháp loại gốc tự do DPPH .74
3.1.5. Khảo sát khả năng ức chế enzym xanthin oxidase của một số dược liệu 79
3.1.6. So sánh kết quả chống oxy hóa in vitro của 4 phương pháp FRAP, MDA,
DPPH và ức chế xanthin oxidase .81
3.2. XÁC ĐỊNH DƯỢC LIỆU CHO PHÂN TÍCH HÓA HỌC VÀ SINH HỌC .84
3.2.1. Đánh giá khả năng chống oxy hóa của 4 dược liệu trên sắc ký lớp mỏng 84
3.2.2. Sơ bộ phân tích thành phần hóa học của Nghể và Râu mèo 856
3.2.2.1. Phân tích sơ bộ thành phần hóa học của cây Râu mèo 86
3.2.2.2. Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật cây Nghể 87
3.3. KHẢO SÁT HÓA HỌC, TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA VÀ TÁC DỤNG
BẢO VỆ TẾ BÀO GAN EX VIVO CỦA CÂY RÂU MÈO .88
3.3.1. Chiết xuất, phân tách các phân đoạn có tác dụng chống oxy hóa và bảo vệ tế
bào gan ex vivo của cây Râu mèo .88
3.3.1.1. Kết quả sàng lọc các phân đoạn chống oxy hóa bằng phương pháp FRAP 89
V
3.3.1.2. Kết quả sàng lọc các phân đoạn chống oxy hóa bằng phương pháp DPPH .89
3.3.1.3. Chuẩn hóa qui trình thử tác dụng bảo vệ gan ex vivo .90
3.3.2. Tách phân đoạn có tác dụng chống oxy hóa và bảo vệ gan từ OA-Et-F .96
3.3.2.1. Tách phân đoạn OA-Et-F bằng phương pháp sắc ký cột .96
3.3.2.2. Hoạt tính chống oxy hóa của các phân đoạn sắc ký cột 97
3.3.2.3. Kết quả bảo vệ tế bào gan của 8 phân đoạn sắc ký cột OA-Et-F 100
3.3.3. Phân lập, xác định cấu trúc và hoạt tính chống oxy hóa của các chất tinh khiết
từ OAE3 .102
3.3.3.1. Phân lập chất tinh khiết từ OAE3 . 102
3.3.3.2. Xác định cấu trúc của hợp chất A1. . 103
3.3.3.3. Khảo sát khả năng chống oxy hóa của acid rosmarinic từ cây Râu mèo 105
3.3.3.4. Khảo sát hoạt tính bảo vệ gan ex vivo của acid rosmarinic 106
3.4. KHẢO SÁT HÓA HỌC, TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA VÀ BẢO VỆ TẾ
BÀO GAN EX VIVO CỦA CÂY NGHỂ POLYGONUM TOMENTOSUM WILLD. 106
3.4.1. Chiết xuất, phân tách các phân đoạn, thử nghiệm chống oxy hóa và bảo vệ tế
bào gan ex vivo của cây Nghể 106
3.4.1.1. Kết quả sàng lọc các phân đoạn chống oxy hóa bằng phương pháp FRAP . 107
3.4.1.2. Kết quả sàng lọc các phân đoạn chống oxy hóa bằng phương pháp DPPH 107
3.4.1.3. Kết quả bảo vệ tế bào gan của các phân đoạn của cây Nghể 108
3.4.2. Tách PT-Et-F bằng phương pháp sắc ký cột, thử hoạt tính chống oxy hóa và
bảo vệ tế bào gan ex vivo của các phân đoạn thu được 110
3.4.2.1. Tách phân đoạn PT-Et-F bằng phương pháp sắc ký cột . 110
3.4.2.2. Hoạt tính chống oxy hóa của các phân đoạn PTE1-PTE11 . 111
3.4.2.3. Kết quả bảo vệ tế bào gan của các phân đoạn sắc ký PT- Et-F 114
3.4.3. Phân lập, xác định cấu trúc và tác dụng chống oxy hóa và bảo vệ tế bào gan ex
vivo của các chất từ phân đoạn PTE8-PTE9 116
3.4.3.1. Phân lập các chất tinh khiết 116
3.4.3.2. Xác định cấu trúc các chất tinh khiết . 118
3.4.3.3. Khảo sát khả năng chống oxy hóa của các chất tinh khiết 128
3.4.3.4. Hoạt tính bảo vệ gan ex vivo của các chất tinh khiết . 129
3.5. THỬ TÁC DỤNG BẢO VỆ GAN TRÊN CHUỘT BỊ NHIỄM ĐỘC CCl4 CỦA 2
CÂY RÂU MÈO VÀ NGHỂ .130
VI
3.5.1. Khảo sát phương pháp .130
3.5.2. Đánh giá tác dụng bảo vệ gan của phân đoạn, chất tinh khiết của cây Râu mèo 131
3.5.2.1. So sánh hoạt tính bảo vệ gan in vivo của OA-Et-F 131
3.5.2.2. Hoạt tính bảo vệ gan in vivo của chất tinh khiết của cây Râu mèo 1323
3.5.3. Đánh giá tác dụng bảo vệ gan của các phân đoạn, các chất tinh khiết của cây
Nghể .134
3.5.3.1. Đánh giá hoạt tính bảo vệ gan của PT-Et-F trên chuột . 134
3.5.3.2. Hoạt tính bảo vệ gan in vivo của các chất tinh khiết của cây Nghể . 136
3.6. XÁC ĐỊNH ĐỘC TÍNH CẤP DIỄN CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN VÀ CÁC CHẤT
TINH KHIẾT CỦA 2 CÂY RÂU MÈO VÀ NGHỂ .138
3.6.1. Xác định độc tính của phân đoạn và chất tinh khiết của cây Râu mèo 138
3.6.2. Khảo sát độc tính của cao chiết và chất tinh khiết của cây Nghể . 139
CHƯƠNG 4- KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .142
Danh Muïc Coâng Trình . 146
TAØI LIEÄU THAM KHAÛO 146
PHỤ LỤC A - Phần in vitro 161
PHỤ LỤC B - Phần ex vivo và in vivo 182
PHỤ LỤC C – Phần phổ . 195