Thạc Sĩ Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng chống oxy hóa của một số cây thuốc hướng tác dụng trên gan

MỞ ĐẦU
Gốc tự do là một tác nhân độc hại gây ra nhiều bệnh như bệnh về đường tim mạch, các bệnh về gan, đục thủy tinh thể, lão hóa, ung thư, Về mặt hóa học, gốc tự do rất kém bền nên dễ dàng tham gia vào nhiều phản ứng hóa học với các hợp chất như protein, lipid, carbohydrat, DNA, trong cơ thể. Điều này dẫn đến sự rối loạn và mất cân bằng của các quá trình sinh hóa và là nguyên nhân chính gây nên các bệnh [16], [76]. Do đó, việc tìm ra những hợp chất chống oxy hóa có khả năng ức chế các gốc tự do hoặc ức chế các quá trình gián tiếp sinh ra gốc tự do là điều cần thiết để ngăn ngừa nhiều loại bệnh tật. Các chất chống oxy hóa có thể có nguồn gốc từ thiên nhiên hoặc được tổng hợp hóa học. Tuy nhiên, những hợp chất chống oxy hóa được tổng hợp hóa học có thể gây ung thư nên việc sử dụng các hợp chất có nguồn gốc từ tự nhiên có thể hạn chế được nguy cơ này [105], [137]. Nguồn thực vật ở Việt Nam khá phong phú và đa dạng vì Việt Nam là quốc gia nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, có hệ thực vật phong phú (trên 12.000 loài thực vật bậc cao) với nguồn dược liệu dồi dào và truyền thống sử dụng dược liệu có nguồn gốc tự nhiên từ lâu đời (gần 4000 loài cây thuốc). Đây là một nguồn nguyên liệu vô cùng quý giá cho các nghiên cứu về hợp chất thiên nhiên, cũng như những nghiên cứu về hoạt tính sinh học theo hướng hiện đại. Nguồn dược liệu tự nhiên không chỉ bổ sung thuốc cho hóa trị liệu, mà còn góp phần không nhỏ vào việc khắc phục các tác dụng phụ do các hóa chất tổng hợp gây nên. Nguồn tài nguyên đa dạng của sinh giới kết hợp với sự phát triển không ngừng
của khoa học công nghệ và tiến bộ của các thiết bị nghiên cứu là cơ sở khoa học giúp con người tìm ra thuốc mới đề phòng và chống lại các loại bệnh tật. Ngày nay, các chứng bệnh về gan đang trở thành một trong số bệnh phổ biến và có nguy cơ tử vong cao ở Việt Nam cũng như trên thế giới. Theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới (WHO), trên thế giới có khoảng 2 tỉ người nhiễm viêm gan B và có khoảng một triệu người tử vong do biến chứng của viêm gan B như xơ gan, ung thu gan, chưa kể số người bị nhiễm viêm gan A, C và những bệnh lý khác về gan như gan bị nhiễm độc, nhiễm mỡ, loạn chức năng gan, xơ gan do môi trường sống, do sử dụng kháng sinh và thói quen ăn uống (sử dụng dầu bị peroxid hóa, uống rượu bia ) [48], [138], [143].
Gan có vai trò quan trọng trong quá trình sinh lý học của cơ thể sống do gan tham gia trong quá trình trao đổi chất, tổng hợp và dự trữ. Ngoài ra gan còn giải độc những hoá chất gây độc cho cơ thể và tiết ra mật để tiêu hoá lipid. Những bệnh lý khác nhau của gan phần lớn do sự peroxid hóa và stress oxy hóa. Các bệnh về gan gây ảnh hưởng trực tiếp đến sức khoẻ và giảm tuổi thọ. Người bị bệnh gan nặng như xơ gan, ung thư gan, áp xe gan có thể dẫn đến tử vong [48]. Thuốc chữa bệnh gan chủ yếu có nguồn gốc từ thực vật. Những loại thuốc này có tác dụng trị bệnh gan chủ yếu là do khả năng chống oxy hóa, phục hồi tế bào gan, tăng tiết mật đã được sử dụng lâu đời trong dân gian dưới dạng thuốc sắc và trong y học hiện đại sử dụng dưới dạng cao chiết toàn phần hay hoạt chất tinh khiết. Nhiều loại thuốc chữa bệnh hiện nay của y học hiện đại được phát triển từ những dược liệu, bài thuốc cổ truyền bằng các nghiên cứu theo định hướng của các thử nghiệm sinh học, từ đó, thu được hoạt chất tinh khiết có tác dụng đáp ứng được yêu cầu của y học hiện đại. Các nhà nghiên cứu đã phân lập và xác định được cấu trúc của hơn 160 chất từ 101 loài thực vật khác nhau có hoạt tính bảo vệ gan. Những loại chất này thuộc các nhóm hợp chất là phenyl propanoid, terpenoid, flavonoid, các loại acid hữu cơ và chất béo, hợp chất có nitơ [78], [143]. Ngày nay, những nghiên cứu theo định hướng của các thử nghiệm sinh học đã được chứng minh là hướng đi đúng đắn có thể giúp tìm ra được các dược liệu, các hoạt chất từ dược liệu có tác dụng điều trị. Hướng đi này hiện được nhiều nhà nghiên cứu trên thế giới áp dụng để nghiên cứu các chất có tác dụng chống oxy hóa bảo vệ gan.
Mục tiêu đề tài
Trên cơ sở kế thừa những tinh hoa của y học cổ truyền kết hợp với những tiến bộ của khoa học hiện đại, đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng chống oxy hóa của một số cây thuốc hướng tác dụng trên gan” được thực hiện với mục tiêu sàng lọc, nghiên cứu về hoạt tính chống oxy hóa của một số cây thuốc trong nguồn tài nguyên cây thuốc phong phú của Việt Nam,. góp phần vào việc tìm ra những dược liệu và các chất có trong dược liệu có khả năng sử dụng trong phòng ngừa và điều trị một số bệnh gan hiện nay. Những nội dung nghiên cứu của đề tài
- Sàng lọc một số cây thuốc được sử dụng điều trị bệnh liên quan đến gan trên một số mô hình thử nghiệm sàng lọc chống oxy hóa. Từ đó chọn ra một hoặc một vài cây có tác dụng tốt nhất để nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng sinh học.
- Nghiên cứu chiết xuất, phân tách các phân đoạn và phân lập các hợp chất tinh khiết từ các dược liệu đã chọn theo định hướng của các thử nghiệm sinh học để tìm ra các phân đoạn đơn giản và các chất tinh khiết có hoạt tính chống oxy hóa và tác dụng bảo vệ tế bào gan.
- Xác định cấu trúc hóa học của các hoạt chất đã phân lập được.
- Đánh giá tác dụng sinh học của một số phân đoạn của dược liệu và các chất tinh khiết phân lập được trên các mô hình thử nghiệm dược lý và độc tính trên gan.
Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của luận án
Những đóng góp của luận án:
- Nghiên cứu sàng lọc tác dụng chống oxy hóa của các dược liệu: Đã đánh giá tác dụng chống oxy hóa của 180 cao chiết của 56 dược liệu trên các mô hình thử nghiệm chống oxy hóa in vitro FRAP, MDA, DPPH và xanthin oxidase, đã tìm ra được một số dược liệu và phân đoạn chiết của dược liệu có tác dụng chống oxy hóa tốt giúp định hướng cho các nghiên cứu cũng như việc sử dụng các dược liệu sau này. Đề tài đã xác định được tác dụng chống oxy hóa của 10 dược liệu và 4 bộ phận dùng của dược liệu mà chưa có nghiên cứu trong và ngoài nước đề cập đến là Bupleurum sinense, Crescentia cujete, Carica papaya (lá), Datura metel, Desmodium heterophyllum, Dolichos lablab, Durio zibethinus, Milletia sp., Momordica charantia (rễ), Morinda persicaefolia, Oroxylum indicum (vỏ thân), Oxalis corniculata, Polygonum tomentosum. Trong các dược liệu đã khảo sát có 4 dược liệu có tác dụng chống oxy hóa mạnh nhất là Polygonum tomentosum, Durio zibethinus (rễ), Orthosiphon aristatus, Milletia sp. Hai dược liệu Orthosiphon aristatus (Râu mèo) và Polygonum tomentosum (Nghể) đã được nghiên cứu sâu hơn về hóa học và tác dụng sinh học trên gan. - Nghiên cứu về hóa học: Đã định tính sơ bộ thành phần hóa học của cây Nghể (P.tomentosum) mà chưa có bất cứ tài liệu nào công bố. Cây Nghể có nhiều các hoạt chất polyphenol như flavonoid và tanin là những chất được biết có tính chống oxy hoá mạnh. Ba flavonoid được phân lập và định danh từ cây Nghể (quercitrin, quercetin-3-O-D-glucuronic và hyperin) là các flavonoid lần đầu tiên được báo cáo là thành phần của loài này.
- Nghiên cứu về tác dụng chống oxy hóa và bảo vệ gan của Râu mèo và Nghể: Phân đoạn chiết ethyl acetat của hai cây Râu mèo và Nghể, acid rosmarinic. quercitrin, quercetin-3-O-D-glucuronic đều có tác dụng chống oxy hóa mạnh và bảo vệ gan khá tốt. Phân đoạn chiết ethyl acetat của 2 cây có tác dụng bảo vệ gan gần tương đương với silymarin. Trong đó tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ gan của phân đoạn ethyl acetat của 2 cây Râu mèo và Nghể và tác dụng bảo vệ gan của acid rosmarinic, quercetin-3-O-D-glucuronic chưa thấy được công bố trong bất kỳ tài liệu nào trong và ngoài nước. Các kết quả nghiên cứu của luận án đã mở ra hướng nghiên cứu ứng dụng của cây Râu mèo và Nghể trong bảo vệ và điều trị bệnh gan nói riêng và trong việc phòng ngừa nhiều loại bệnh tật nói chung. Cây Râu mèo (Orthosiphon aristatus) là một loài cây thuốc đã được sử dụng rộng rãi trên thế giới để làm thuốc lợi tiểu, lợi mật. Kết quả nghiên cứu của luận án đã mở ra hướng sử dụng dược liệu này trong điều trị bệnh lý của gan với tác dụng chống oxy hóa, góp phần tăng thêm giá trị sử dụng của cây thuốc này. Riêng với cây Nghể (Polygonum tomentosum) - một loài cây mọc hoang dại, gặp ở nhiều vùng trong nước nhưng việc sử dụng làm thuốc vẫn còn giới hạn; các kết quả nghiên cứu cho thấy đây là một loài cây thuốc có giá trị trong chống oxy hóa, dập tắt gốc tự do, bảo vệ gan và mở ra hướng nghiên cứu cho các đề tài tiếp theo về cả hóa học và tác dụng sinh học theo hướng sử dụng loài thực vật này trong sử dụng làm thuốc trị bệnh gan. Các kết quả nghiên cứu cũng chứng minh tính đúng đắn của hướng nghiên cứu cây thuốc theo định hướng của tác dụng sinh học. Với định hướng này tác dụng bảo vệ gan của Râu mèo đã được phát hiện với acid rosmarinic là một trong những thành phần chính có tác dụng.

MỤC LỤC
Lời cam đoan I
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt VII
Danh mục các bảng .X
Danh mục các hình . XII
Danh mục sơ đồ XIV
MỞ ĐẦU .1
CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 6
1.1. TỔNG QUAN VỀ GỐC TỰ DO VÀ CHẤT CHỐNG OXY HÓA 6
1.1.1. Gốc tự do .6
1.1.1.1. Khái niệm về gốc tự do .6
1.1.1.2. Nguồn gốc phát sinh gốc tự do trong cơ thể 6
1.1.1.3. Vai trò của gốc tự do trong cơ thể .10
1.1.2. Các chất chống oxy hóa .16
1.1.2.1. Chất chống oxy hóa có bản chất enzym 16
1.2.2.2. Chất chống oxy hóa không có bản chất enzym 18
1.2. TỔNG QUAN VỀ GAN VÀ BỆNH LÝ CỦA GAN DO OXY HÓA .23
1.2.1. Cấu trúc gan và các loại tế bào có trong gan .23
1.2.2. Vai trò của các gốc tự do trong phát sinh bệnh trong gan .24
1.2.2.1. Vai trò của gốc tự do trong sự gây tổn thương gan do thiếu máu cục bộ .24
1.2.2.2. Vai trò của gốc tự do trong bệnh gan nhiễm mỡ không do cồn .26
1.2.2.3. Vai trò của gốc tự do trong bệnh xơ hóa gan .28
1.2.2.4. Stress oxy hóa trong bệnh viêm gan siêu vi C 28
1.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC SÀNG LỌC DƯỢC LIỆU CÓ KHẢ NĂNG
CHỐNG OXY HÓA VÀ BẢO VỆ GAN 29
1.3.1. Các phương pháp đánh giá khả năng chống oxy hoá 30
1.3.1.1. Phương pháp phân tích FRAP .30
1.3.1.2. Phương pháp đánh giá khả năng loại gốc tự do DPPHã 31
1.3.1.3. Phương pháp đo MDA .31
1.3.1.4. Phương pháp đánh giá khả năng antioxidant với hệ thống β-caroten- acid linoleic32
III
1.3.1.5. Phương pháp ức chế enzym xanthin oxidase .33
1.3.2. Phương pháp xác dịnh hoạt tính bảo vệ gan trên gan bị gây độc bởi CCl4 gây
độc tế bào .33
1.3.3. Phương pháp phân tích hoạt tính bảo vệ gan do galactosamin gây độc tế bào
nuôi cấy 34
1.3.4. Phương pháp phân tích hoạt tính bảo vệ gan in vivo 34
1.4. TỔNG QUAN VỀ MỘT SỐ CÂY THUỐC TRỊ BỆNH GAN .34
1.4.1. Râu mèo .36
1.4.2. Chi Polygonum 40
1.4.3. Giới thiệu về cây Cúc gai .44
CHƯƠNG 2 - NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 47
2.1. NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT NGHIÊN CỨU 47
2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu .47
2.1.2. Trang thiết bị 49
2.1.3. Hóa chất .50
2.1.3.1. Hóa chất sử dụng cho nghiên cứu hóa học và chiết xuất .50
2.1.3.2. Hóa chất sử dụng cho thử nghiệm sinh học .50
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 50
2.2.1. Xác định mẫu .50
2.2.2. Nghiên cứu hóa học .51
2.2.2.1. Phương pháp chiết xuất để sàng lọc tác dụng chống oxy hóa .51
2.2.2.2. Sơ bộ khảo sát thành phần hóa học 52
2.2.2.3. Chiết xuất cho nghiên cứu hóa học và sinh học .52
2.2.2.4. Sắc ký lớp mỏng .54
2.2.2.5. Phân tách các phân đoạn và phân lập các hợp chất .54
2.2.3. Nghiên cứu xác định cấu trúc của các chất tinh khiết 54
2.2.4. Các phương pháp sàng lọc khả năng chống oxy hóa .54
2.2.4.1. Phương pháp FRAP 54
2.2.4.2. Phương pháp đo MDA .55
2.2.4.3. Phương pháp sàng lọc khả năng loại gốc tự do DPPH .56
2.2.4.4. Phương pháp xác định khả năng ức chế enzym xanthin oxidase .56
2.2.5. Thử tác dụng sinh học bảo vệ tế bào gan ex vivo .57
IV
2.2.5.1. Quy trình rửa và phân tách tế bào gan 57
2.2.5.2. Phương pháp đếm số lượng tế bào bằng thuốc nhuộm Trypan blue .59
2.2.5.3. Phương pháp đo hoạt độ enzym alanin aminotransferase (ALT/GPT) 59
2.2.5.4. Cách chuẩn bị mẫu và dịch tế bào gan 60
2.2.5.5. Bố trí nhóm thí nghiệm .60
2.2.5.6. Thiết kế thí nghiệm 61
2.2.6. Phương pháp thử tác dụng sinh học trên mô hình in vivo 62
2.2.6.1. Bố trí nhóm thí nghiệm .62
2.2.6.2. Phương pháp tiến hành 62
2.2.6.3. Thiết kế thí nghiệm 63
2.2.7. Thử nghiệm độc tính cấp diễn .63
2.2.8. Phương pháp xử lí số liệu 64
CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 65
3.1. KẾT QUẢ SÀNG LỌC TÁC DỤNG SINH HỌC CHỐNG OXY HÓA IN VITRO
CỦA CÁC DƯỢC LIỆU .65
3.1.1. Chiết xuất các dược liệu thu cho thử nghiệm in vitro 65
3.1.2. Kết quả chống oxy hóa in vitro theo phương pháp FRAP .67
3.1.3. Kết quả chống oxy hóa in vitro theo phương pháp MDA .71
3.1.4. Kết quả chống oxy hóa in vitro theo phương pháp loại gốc tự do DPPH .74
3.1.5. Khảo sát khả năng ức chế enzym xanthin oxidase của một số dược liệu 79
3.1.6. So sánh kết quả chống oxy hóa in vitro của 4 phương pháp FRAP, MDA,
DPPH và ức chế xanthin oxidase .81
3.2. XÁC ĐỊNH DƯỢC LIỆU CHO PHÂN TÍCH HÓA HỌC VÀ SINH HỌC .84
3.2.1. Đánh giá khả năng chống oxy hóa của 4 dược liệu trên sắc ký lớp mỏng 84
3.2.2. Sơ bộ phân tích thành phần hóa học của Nghể và Râu mèo 856
3.2.2.1. Phân tích sơ bộ thành phần hóa học của cây Râu mèo 86
3.2.2.2. Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật cây Nghể 87
3.3. KHẢO SÁT HÓA HỌC, TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA VÀ TÁC DỤNG
BẢO VỆ TẾ BÀO GAN EX VIVO CỦA CÂY RÂU MÈO .88
3.3.1. Chiết xuất, phân tách các phân đoạn có tác dụng chống oxy hóa và bảo vệ tế
bào gan ex vivo của cây Râu mèo .88
3.3.1.1. Kết quả sàng lọc các phân đoạn chống oxy hóa bằng phương pháp FRAP 89
V
3.3.1.2. Kết quả sàng lọc các phân đoạn chống oxy hóa bằng phương pháp DPPH .89
3.3.1.3. Chuẩn hóa qui trình thử tác dụng bảo vệ gan ex vivo .90
3.3.2. Tách phân đoạn có tác dụng chống oxy hóa và bảo vệ gan từ OA-Et-F .96
3.3.2.1. Tách phân đoạn OA-Et-F bằng phương pháp sắc ký cột .96
3.3.2.2. Hoạt tính chống oxy hóa của các phân đoạn sắc ký cột 97
3.3.2.3. Kết quả bảo vệ tế bào gan của 8 phân đoạn sắc ký cột OA-Et-F 100
3.3.3. Phân lập, xác định cấu trúc và hoạt tính chống oxy hóa của các chất tinh khiết
từ OAE3 .102
3.3.3.1. Phân lập chất tinh khiết từ OAE3 . 102
3.3.3.2. Xác định cấu trúc của hợp chất A1. . 103
3.3.3.3. Khảo sát khả năng chống oxy hóa của acid rosmarinic từ cây Râu mèo 105
3.3.3.4. Khảo sát hoạt tính bảo vệ gan ex vivo của acid rosmarinic 106
3.4. KHẢO SÁT HÓA HỌC, TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA VÀ BẢO VỆ TẾ
BÀO GAN EX VIVO CỦA CÂY NGHỂ POLYGONUM TOMENTOSUM WILLD. 106
3.4.1. Chiết xuất, phân tách các phân đoạn, thử nghiệm chống oxy hóa và bảo vệ tế
bào gan ex vivo của cây Nghể 106
3.4.1.1. Kết quả sàng lọc các phân đoạn chống oxy hóa bằng phương pháp FRAP . 107
3.4.1.2. Kết quả sàng lọc các phân đoạn chống oxy hóa bằng phương pháp DPPH 107
3.4.1.3. Kết quả bảo vệ tế bào gan của các phân đoạn của cây Nghể 108
3.4.2. Tách PT-Et-F bằng phương pháp sắc ký cột, thử hoạt tính chống oxy hóa và
bảo vệ tế bào gan ex vivo của các phân đoạn thu được 110
3.4.2.1. Tách phân đoạn PT-Et-F bằng phương pháp sắc ký cột . 110
3.4.2.2. Hoạt tính chống oxy hóa của các phân đoạn PTE1-PTE11 . 111
3.4.2.3. Kết quả bảo vệ tế bào gan của các phân đoạn sắc ký PT- Et-F 114
3.4.3. Phân lập, xác định cấu trúc và tác dụng chống oxy hóa và bảo vệ tế bào gan ex
vivo của các chất từ phân đoạn PTE8-PTE9 116
3.4.3.1. Phân lập các chất tinh khiết 116
3.4.3.2. Xác định cấu trúc các chất tinh khiết . 118
3.4.3.3. Khảo sát khả năng chống oxy hóa của các chất tinh khiết 128
3.4.3.4. Hoạt tính bảo vệ gan ex vivo của các chất tinh khiết . 129
3.5. THỬ TÁC DỤNG BẢO VỆ GAN TRÊN CHUỘT BỊ NHIỄM ĐỘC CCl4 CỦA 2
CÂY RÂU MÈO VÀ NGHỂ .130
VI
3.5.1. Khảo sát phương pháp .130
3.5.2. Đánh giá tác dụng bảo vệ gan của phân đoạn, chất tinh khiết của cây Râu mèo 131
3.5.2.1. So sánh hoạt tính bảo vệ gan in vivo của OA-Et-F 131
3.5.2.2. Hoạt tính bảo vệ gan in vivo của chất tinh khiết của cây Râu mèo 1323
3.5.3. Đánh giá tác dụng bảo vệ gan của các phân đoạn, các chất tinh khiết của cây
Nghể .134
3.5.3.1. Đánh giá hoạt tính bảo vệ gan của PT-Et-F trên chuột . 134
3.5.3.2. Hoạt tính bảo vệ gan in vivo của các chất tinh khiết của cây Nghể . 136
3.6. XÁC ĐỊNH ĐỘC TÍNH CẤP DIỄN CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN VÀ CÁC CHẤT
TINH KHIẾT CỦA 2 CÂY RÂU MÈO VÀ NGHỂ .138
3.6.1. Xác định độc tính của phân đoạn và chất tinh khiết của cây Râu mèo 138
3.6.2. Khảo sát độc tính của cao chiết và chất tinh khiết của cây Nghể . 139
CHƯƠNG 4- KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .142
Danh Muïc Coâng Trình . 146
TAØI LIEÄU THAM KHAÛO 146
PHỤ LỤC A - Phần in vitro 161
PHỤ LỤC B - Phần ex vivo và in vivo 182
PHỤ LỤC C – Phần phổ . 195