Thạc Sĩ Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào của cây Bạch trinh biển (Hymenocallis litt

LUẬN ÁN TIẾN SĨ
NĂM 2014



MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3
1.1. Thực vật họ Thủy tiên (Amaryllidaceae), chi Bạch trinh (Hymenocallis) và loài
Bạch trinh biển (Hymenocallis littoralis) 3
1.1.1. Thực vật họ Thủy tiên (Amaryllidaceae) . 3
1.1.2. Thực vật chi Bạch trinh (Hymenocallis) và loài Bạch trinh biển
(Hymenocallis littoralis) . 3
1.2. Thành phần hóa học họ Thủy tiên (Amaryllidaceae), chi Bạch trinh
(Hymenocallis) và loài Bạch trinh biển (Hymenocallis littoralis) 6
1.2.1. Thành phần hóa học họ Thủy tiên (Amaryllidaceae) . 6
1.2.2. Thành phần hóa học chi Bạch trinh (Hymenocallis) và loài Bạch trinh biển
(Hymenocallis littoralis) 11
1.3. Hoạt tính sinh học của họ Thủy tiên (Amaryllidaceae), chi Bạch trinh
(Hymenocallis) và loài Bạch trinh biển (Hymenocallis littoralis) 27
1.3.1. Hoạt tính sinh học của họ Thủy tiên (Amaryllidaceae) .27
1.3.2.Hoạt tính sinh học của chi Bạch trinh (Hymenocallis) và loài Bạch trinh biển
(Hymenocallis littoralis) 30
CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM .33
2.1. Mẫu thực vật 33
2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất 33
2.2.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC) .33
2.2.2. Sắc ký cột (CC) 33
2.2.3. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 33
2.3. Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất 33
2.3.1. Phổ hồng ngoại (FT-IR) .34
2.3.2. Phổ khối lượng (ESI-MS) 34
2.3.3. Phổ khối lượng phân giải cao (FT-ICR-MS) 34
2.3.4. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 34
2.3.5. Điểm nóng chảy .34
2.3.6. Độ quay cực riêng 34
2.4. Phương pháp thử hoạt tính sinh học 35
2.5. Phân lập các hợp chất .35
2.5.1. Xử lý mẫu thực vật và chiết tách cây Bạch trinh biển .35
2.5.2. Phân lập các hợp chất từ cặn HLF 36
2.5.2.1. Phân lập các hợp chất HLB2, HLB4, HLB5 từ cặn HLF 36
2.5.2.2. Phân lập các hợp chất HLB1, HL53, HLB12, HLB13 và HLB14 38
2.5.3. Phân lập các hợp chất .41
2.5.3.1. Phân lập các hợp chất HLB8, HLB9, HLB10 và HL22 41
3.5.3.2. Phân lập các hợp chất HLB6, HLB7, HLB11 và HLB17 .42
2.6. Chuyển hóa một số alkaloid 44
2.6.1. Axetyl hóa tazettine .44
2.6.2. Axetyl hóa lycorine 45
2.6.3.Axetyl hóa haemanthamine .45
2.7. Hằng số vật lý và các dữ liệu phổ của các hợp chất đã phân lập 46
2.7.1. Hợp chất HLB1 46
2.7.2. Hợp chất HLB2 47
2.7.3. Hợp chất HLB4 47
2.7.4. Hợp chất HLB13 48
2.7.5. Hợp chất HL53 49
2.7.6. Hợp chất HLB5 49
2.7.7. Hợp chất HLB12 50
2.7.8. Hợp chất HLB14 50
2.7.9. Hợp chất HLB6 51
2.7.10. Hợp chất HLB7 51
2.7.11. Hợp chất HLB8 52
2.7.12. Hợp chất HLB9 53
2.7.13. Hợp chất HLB10 54
2.7.14. Hợp chất HLB11 54
2.7.15. Hợp chất HLB17 55
2.7.16. Hợp chất HL22 56
2.8. Hằng số vật lý và các dữ liệu phổ của các dẫn xuất axetyl hóa các alkaloid 57
2.8.1. Hợp chất TA2 57
2.8.2. Hợp chất LY1 58
2.8.3. Hợp chất LY2 58
2.8.4. Hợp chất HA1 59
2.9. Hoạt tính sinh học của các cặn chiết, hợp chất đã phân lập và bán tổng hợp .60
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 63
3.1. Mẫu thực vật 63
3.2. Phân lập các hợp chất .63
3.3. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập được từ cây Bạch trinh biển 63
3.3.1. Hợp chất HLB1 63
3.3.2. Hợp chất HLB2 66
3.3.3. Hợp chất HLB4 68
3.3.4. Hợp chất HLB13 69
3.3.5. Hợp chất HL53 (chất mới) .71
3.3.6. Hợp chất HLB5 78
3.3.7. Hợp chất HLB12 79
3.3.8. Hợp chất HLB14 81
3.3.9. Hợp chất HLB6 82
3.3.10 Hợp chất HLB7 .84
3.3.11 Hợp chất HLB8 .86
3.3.12. Hợp chất HLB9 88
3.3.13. Hợp chất HLB10 90
3.3.14. Hợp chất HLB11 92
3.3.15. Hợp chất HLB17 93
3.3.16. Hợp chất HL22 (chất mới) .95
3.4. Tổng hợp các dẫn xuất của một số alkaloid phân lập được từ cây Bạch trinh
biển (Hymenocallis littoralis) 102
3.4.1. Hợp chất TA2 . 105
4.4.2.Hợp chất LY1 107
4.4.3.Hợp chất LY2 108
4.4.4.Hợp chất HA1 . 110
3.5. Hoạt tính gây độc tế bào của cây Bạch trinh biển (Hymenocallis littoralis) 112
3.5.1. Hoạt tính gây độc tế bào của các dịch chiết, các hợp chất phân lập 113
3.5.1.1. Hoạt tính gây độc tế bào của các dịch chiết . 113
3.5.1.2. Hoạt tính gây độc tế bào của các flavonoid và chromone . 113
3.5.1.3. Hoạt tính gây độc tế bào của các alkaloid 115
3.5.2. Hoạt tính gây độc tế bào của các dẫn xuất axetyl hóa các alkaloid 116
KẾT LUẬN . 121
TÀI LIỆU THAM KHẢO 123
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 141
PHỤ LỤC 142


MỞ ĐẦU


Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, được thiên nhiên ưu đãi nên có một
hảm thực vật rất phong phú và đa dạng. Hiện nay các nhà khoa học đã phát hiện được gần
2.000 loài thực vật bậc cao thuộc hơn 2.256 chi, 305 họ (chiếm 4% tổng số loài, 15% tổng
ố chi, 57% tổng số họ thực vật trên thế giới); 69 loài thực vật hạt trần; 12.000 loài thực vật
ạt kín; 2.200 loài nấm; 2.176 loài tảo; 481 loài rêu; 368 loài vi khuẩn lam; 691 loài dương
và 100 loài khác. Trong đó có 50% số loài thực vật bậc cao là các loài có tính chất bản địa,
ác loài di cư từ Hymalia - Vân Nam - Quý Châu xuống chiếm 10%, các loài di cư từ Ấn Độ
Myanma sang chiếm 14%, các loài từ Indonesia - Malaysia di cư lên chiếm 15%, còn lại là
ác loài có nguồn gốc hàn đới và nhiệt đới khác [21]
Trong các loài thực vật bậc cao có khoảng gần 4.000 loài được ông cha ta sử dụng
ong các bài thuốc cổ truyền của dân tộc ngay từ cổ xưa [2]. Ngày nay, cùng với sự phát
iển của khoa học kỹ thuật nói chung, y học nói riêng, nền y học cổ truyền dân tộc đang có
hững đóng góp to lớn cùng với y học hiện đại góp phần vào việc phòng, chữa bệnh nhằm
m tăng tuổi thọ của con người và chất lượng cuộc sống. Cũng chính vì vậy mà việc điều tra
ghiên cứu về hóa học và hoạt tính sinh học của các loài cây thuốc có giá trị cao của Việt
Nam nhằm đặt cơ sở khoa học cho việc sử dụng chúng một cách hợp lý, có hiệu quả nhất có
ở nên đặc biệt quan trọng.
Theo hướng nghiên cứu này, rất nhiều dược phẩm có nguồn gốc từ thảo dược đã được
ng dụng như rutin từ Hoa hòe chữa một số bệnh tim mạch [12]; artemisinin chiết xuất từ cây
hanh hao hoa vàng và rất nhiều dẫn xuất của nó như artemether, arteether, artesunate chữa
ệnh sốt rét ác tính [35]; berberin được chiết xuất từ một số loại cây như cây Vàng đắng dùng
ể chữa bệnh tiêu chảy đường ruột [11]; curcumin được chiết xuất từ củ Nghệ vàng dùng để
hữa một số bệnh viêm loét dạ dày và đường tiêu hóa [10] Ngoài ra, hiện nay còn có viên
ang Crila chiết xuất từ cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum lattifolium) - họ Thủy tiên
Amaryllidaceae) có tác dụng chữa u xơ tử cung và u xơ tiền liệt tuyến [14, 15]. Việc nghiên
ứu hóa học và hoạt tính sinh học của các hợp chất có nguồn thiên nhiên, đặc biệt là từ nguồn
thực vật ngày càng đóng góp phần quan trọng vào sự phát triển của nhiều lĩnh vực của cuộc
sống con người. Không những nó đóng góp trực tiếp vào việc tìm kiếm các loại thuốc mới
mà còn góp phần giải thích tác dụng chữa bệnh của các cây thuốc cổ truyền dân tộc mà cha
ông chúng ta đã từng sử dụng.
Nhiều loài thuộc họ Thủy tiên (Amaryllidaceae) đã và đang được nghiên cứu về thành
phần hoạt chất mà chủ yếu là hóa học alkaloid và hoạt tính sinh học trên thế giới, trong đó có
các loài Hymenocallis. Ở Việt Nam, các loài Hymenocallis thường cho hoa đẹp và do đó
được trồng làm cây cảnh. Mặc dù các loài Hymenocallis đã được các nhà khoa học trên thế
giới bắt đầu nghiên cứu từ những năm 1920 [81], nhưng ở Việt Nam hiện nay mới chỉ có
một công trình nghiên cứu về loài Hymenocallis speciosa (Bạch trinh đẹp) và cũng mới chỉ
dừng ở mức độ nghiên cứu về thành phần hóa học mà chưa nghiên cứu sâu về hoạt tính sinh
học [13].
Mục đích của luận án này là nghiên cứu loài Bạch trinh biển (Hymenocallis littoralis)
của Việt Nam về các alkaloid và các thành phần khác nhằm đóng góp một phần vào hướng
nghiên cứu về ngành hợp chất thiên nhiên ở Việt Nam - đã và đang rất có triển vọng ứng
dụng trong ngành công nghiệp dược phẩm.
Nội dung chính của luận án gồm:
 Tìm phương pháp thích hợp để thu nhận các cặn chiết tổng alkaloid và các thành phần
hóa học khác từ loài Bạch trinh biển (Hymenocallis littoralis) của Việt Nam;
 Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào của các cặn chiết tổng alkaloid và các thành phần
hóa học khác;
 Phân lập các thành phần alkaloid và các thành phần hóa học khác loài Bạch trinh biển
(Hymenocallis littoralis);
 Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được;
 Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào của một số hợp chất tinh khiết và một số dẫn xuất
bán tổng hợp nhận được trong luận án.
Các kết quả nghiên cứu nhằm đóng góp nghiên cứu sâu hơn về thành phần hóa học có
trong loài Bạch trinh biển (Hymenocallis littoralis) được nghiên cứu và tạo cơ sở khoa học
cho việc ứng dụng thực tiễn của loài cây này.





TÓM TẮT KẾT LUẬN MỚI CỦA LUẬN ÁN
1. Lần đầu tiên cây Bạch trinh biển (Hymenocallis littoralis) được nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào tại Việt Nam.
2. Bằng phương pháp sắc ký đã phân lập được 16 chất trong đó có 2 hợp chất mới (pseudotazettine; 5,7-dihydroxy-6,8-dimethoxy-2-methyl-H-4-chromen-4-one) và 8 hợp chất lần đầu tiên được phân lập từ cây Bạch trinh biển (Hymenocallis littoralis) (O-methyl-pretazettine; 3',7-dihydroxy-4'-methoxy-8-methylflavan; 3',7-dihydroxy-4'-methoxyflavan; 5-hydroxy-7-methoxy-2-methyl-4H-chomen-4-one; 5,7-dihydroxy-6-methoxy-2-methylchromone; (2S)-7,4'-dihydroxyflavan; 5,7-dihydroxy-2-methylchromone). Cấu trúc hóa học của các hợp chất nói trên được xác định bằng các phương pháp phổ hiện đại như: FT-IR, 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT 135, DEP 90, HSQC, HMBC, ESI-MS, FT-ICR-MS.
3. Đã thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào của cặn tổng (HLT), cặn chiết alkaloid tổng (ở pH > 8, HLA)cặn chiết các thành phần hóa học khác (ở pH < 6, HLF), các hợp chất tinh khiết phân lập được và dẫn xuất axetyl hóa các alkaloid.
 Các cặn HLT, HLA và HLF có hoạt tính kháng ung thư mạnh trên hai dòng tế bào ung thư biểu mô (KB) và dòng tế bào ung thư gan (Hep-G2).
 Các hợp chất: 3',7-dihydroxy-4'-methoxy-8-methylflavan (HLB2); haemanthamine (HLB8); lycorine (HLB10) có hoạt tính kháng ung thư mạnh trên hai dòng tế bào ung thư biểu mô (KB) và dòng tế bào ung thư gan (Hep-G2). Điểm đặc biệt đáng chú ý hợp chất 5,7-dihydroxy-2-methylchromone (HLB14) có hoạt tính kháng ung thư rất mạnh đối với hai dòng tế bào ung thư trên ở giá trị IC50 là 0,46 àg/ml (ung thư biểu mô (KB)) và 0,59 àg/ml (ung thư gan (Hep-G2).
 Các hợp chất axetyl hóa: 11-O-acetyltazettine (TA2); 1,2-O,O'-diacetyllycorine (LY1); 2-O-acetyllycorine (LY2) và 11-O-acetylhaemanthamine (HA1) tuy không có hoạt tính mạnh lắm đối với hai dòng tế bào ung thư biểu mô (KB) và dòng tế bào ung thư gan (Hep-G2) nhưng đây là lần đầu tiên các dẫn xuất axetyl của tazettine, lycorine và haemanthamine được thử hoạt tính gây độc trên hai dòng tế bào này.