Luận Văn Nghiên cứu thẩm định quy trình phân tích các chỉ tiêu hóa học trong vacxin cúm A/H1N1/09

Khóa luận tốt nghiệp năm 2011
Đề tài: Nghiên cứu thẩm định quy trình phân tích các chỉ tiêu hóa học trong vacxin cúm A/H1N1/09

MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ . 8
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 10
1.1.Tình hình bệnh cúm A/H1N1 và nghiên cứu sản xuất vacxin cúm A/H1N1. 10
1.2.Sản xuất vacxin cúm trên trứng gà có phôi . 11
1.2.1.Quy trình sản xuất và kiểm định vacxin cúm trên trứng gà có phôi. 11
1.2.2.Tiêu chuẩn chất lượng của vacxin cúm A/H1N1. 13
1.3.Những yêu cầu và căn cứ pháp lý về thực hành tốt phòng thí nghiệm và thẩm
định quy trình phân tích. 13
1.4.Thẩm định quy trình phân tích. 15
1.4.1.Phạm vi thẩm định, tái thẩm định 15
1.4.2.Các yêu cầu thực hiện để thẩm định quy trình phân tích. 16
1.5.Các chỉ tiêu hóa học trong vacxin và phương pháp định lượng 21
1.5.1.Protein và phương pháp định lượng protein 21
1.5.2.Formaldehyde và các phương pháp định lượng formaldehyde 22
1.5.3.Sucrose và các phương pháp bán định lượng sucrose 24
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26
2.1.Thời gian và địa điểm nghiên cứu 26
2.2.Nguyên vật liệu . 26
2.3.Phương pháp 27
2.3.1.Xác định hàm lượng protein tổng số bằng phương pháp Lowry 27
2.3.2.Xác định hàm lượng formaldehyde tự do bằng phương pháp đo quang
với thuốc thử acetylaceton. 30
2.3.3.Bán định lượng sucrose bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng 32
2.3.4.Thiết kế thực nghiệm và tiêu chuẩn đánh giá các thông số cần thẩm định
của phương pháp phân tích 35
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 38
3.1.Kết quả thẩm định phương pháp xác định Lowry cải tiến 38
3
3.1.1.Độ đúng 38
3.1.2.Độ chính xác. 38
3.1.3.Khoảng tuyến tính 41
3.1.4.Độ đặc hiệu: . 44
3.2.Kết quả thẩm định phương pháp xác định hàm lượng formaldehyde 45
3.2.1.Độ đúng: . 45
3.2.2.Độ chính xác. 45
3.2.3.Khoảng tuyến tính 48
3.2.4.Dải đo. 51
3.2.5.Độ đặc hiệu . 51
3.3.Kết quả thẩm định phương pháp sắc ký lớp mỏng 52
3.4.Kết quả kiểm định hóa học vacxin cúm A/H1N1. 55
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57
4.1.KẾT LUẬN. 57
4.2.KIẾN NGHỊ 57
4
KÍ HIỆU CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT
BĐM : Bình định mức
BSA : Bovine Serum Albumin
CTC : Copper Tartrate Carbonate
CV : Hệ số biến thiên
DAB : Digital Audio Broadcasting
DOC : Sodium deoxycholate
ĐC : Đường chuẩn
ELISA : Enzyme – linked immune sorbent assay
(Thử nghiệm miễn dịch gắn men)
EPA : Environmental Protection Agency
(Cơ quan bảo vệ Môi sinh Hoa Kỳ).
EU : European Union (Liên minh châu Âu)
HA : Haemagglutinin (Kháng nguyên HA)
FP : Function Programming
IARC : International Agency for Research on Cancer
(Cơ quan Quốc tế Nghiên cứu Ung thư)
IU : International Unit (Đơn vị quốc tế)
IVAC : Institute of Vaccines and medical biological
(Viện Vacxin và Sinh phẩm y tế)
LAL : Limulus Amoebocyte Lysate (Thử nghiệm tìm nội độc tố)
NIBSC : National Institute for Biological Standards and Control
(Viện Quốc gia về tiêu chuẩn và Kiểm dịch Sinh học)
GLP : Good Laboratory Practice (Thực hành tốt phòng thí nghiệm)
GMP : Good Manufacturing Practices (Quy phạm thực hành sản xuất tốt)
GTLT : Giá trị lý thuyết
OD : Optical density (Mật độ quang)
PBS : Photphat Buffer Saline (Dung dịch đệm của muối photphat)
5
Ph Eur : The European Pharmacopoeia
SD : Standard Deviation (Độ lệch chuẩn)
SDS : Sodium Dodecyl Sulphate
SRID : Single Radial Immunodifution
(Phản ứng khuếch tán miễn dịch vòng đơn)
TCA : Trichloroacetic Acid
TCYTTG : Tổ chức Y tế Thế giới
TH : Tiến hành
TLC : Thin Layer Chromatography (Sắc ký lớp mỏng)
TSB : Tryptic Soy Broth
WHO : World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới)
6
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Tiêu chuẩn chất lượng của vacxin cúm A/H1N1/09 9. 13
Bảng 1.2: Các chỉ tiêu thẩm định các phương pháp phân tích [3] 20
Bảng 2.1: Bảng tóm tắt thẩm định thử nghiệm kiểm tra hàm lượng X 36
Bảng 2.2: Tổ hợp các điều kiện thử nghiệm để kiểm tra độ chính xác trung
gian. 37
Bảng 3.1: Kết quả sau 5 lần thử nghiệm của phương pháp Lowry cải tiến 38
Bảng 3.2: Kết quả xác định độ lặp lại của phương pháp xác định hàm lượng
protein bằng phương pháp Lowry cải tiến. 39
Bảng 3.3: Tổ hợp các điều kiện thử nghiệm phương pháp Lowry cải tiến. 39
Bảng 3.4: Kết quả xác định độ chính xác trung gian của phương pháp Lowry
cải tiến 40
Bảng 3.5: Phương trình đường chuẩn protein (750nm) 41
Bảng 3.6: Bảng kết quả kiểm tra độ đặc hiệu 44
Bảng 3.7: Kết quả xác định độ chính xác và độ đúng của phương pháp xác
định hàm lượng formol tự do bằng thuốc thử acetylaceton 45
Bảng 3.8: Kết quả xác định độ lặp lại của phương pháp xác định hàm lượng
formol tự do bằng thuốc thử acetylaceton 46
Bảng 3.9: Tổ hợp các điều kiện thử nghiệm phương pháp đo quang bằng thuốc
thử acetylaceton. 46
Bảng 3.10: Kết quả xác định độ chính xác trung gian của phương pháp xác
định hàm lượng formol tự do bằng thuốc thử acetylaceton 47
Bảng 3.11: Phương trình đường chuẩn formol (420nm) . 48
Bảng 3.12: Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu. 51
Bảng 3.13: Kết quả kiểm định hóa học vacxin cúm A/H1N1 55
7
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Quy trình sản xuất và kiểm định vacxin cúm 12
Hình 3.1. Đồ thị đường chuẩn protein 1 . 41
Hình 3.2. Đồ thị đường chuẩn protein 2 . 42
Hình 3.3. Đồ thị đường chuẩn protein 3 . 42
Hình 3.4. Đồ thị đường chuẩn protein 4 . 43
Hình 3.5. Đồ thị đường chuẩn protein 5 . 43
Hình 3.6. Đồ thị đường chuẩn formol 1 48
Hình 3.7. Đồ thị đường chuẩn formol 2 49
Hình 3.8. Đồ thị đường chuẩn formol 3 49
Hình 3.9. Đồ thị đường chuẩn formol 4 50
Hình 3.10. Đồ thị đường chuẩn formol 5 50
Hình 3.11. Bản mỏng mỏng bán định lượng sucrose 1 52
Hình 3.12. Bản mỏng bán định lượng sucrose 2 . 53
Hình 3.13. Bản mỏng bán định lượng sucrose 3 . 54
8
ĐẶT VẤN ĐỀ
Đại dịch cúm 2009 còn gọi là Dịch cúm A/H1N1 (2009), "cúm lợn" (hay
"cúm heo") là dịch cúm do một loại virus thuộc chủng H1N1 lần đầu tiên được các
cơ quan y tế phát hiện vào tháng 3 năm 2009. Cho đến nay, virus cúm gây ra đại
dịch H1N1 2009 đã lan tràn tại hầu hết quốc gia trên toàn thế giới. Trước tình hình
đó, Tổ chức Y tế Thế giới (TCYTTG) đã phát triển mở rộng chương trình cúm toàn
cầu nhằm tìm ra các biện pháp kiểm soát và phòng ngừa nguy cơ bùng phát lan
rộng, trong đó việc phát triển một vacxin có hiệu quả được xem là nền tảng quan
trọng để bảo vệ cộng đồng. Ngày 06/08/2009, Tổ chức Sức khỏe Thế giới (WHO)
đã ra thông báo về quá trình sản xuất vacxin cúm đại dịch H1N1 2009.
Tổ chức Y tế Thế giới đã khuyến cáo các nước nên tự nghiên cứu sản xuất
vacxin cúm A/H1N1 để có thể chủ động trong công tác phòng chống dịch, bảo vệ
sức khỏe cộng đồng [9]. Cùng với việc tạo ra các chủng sản xuất vacxin cúm
A/H1N1 thích hợp bằng kỹ thuật di truyền ngược, các trung tâm nghiên cứu bệnh
cúm quốc tế cũng đưa ra những hướng sản xuất vacxin cúm khác nhau (sản xuất
trên trứng gà có phôi, tế bào động vật ). Trên cơ sở đó, tùy thuộc vào điều kiện
của từng quốc gia mà lựa chọn con đường sản xuất cho phù hợp nhưng phải đảm
bảo tính an toàn và hiệu quả cao.
Tại Việt Nam, Viện Vacxin và Sinh phẩm Y tế Nha Trang đã nghiên sản
xuất vacxin cúm A/H1N1 cho người bằng phương pháp nuôi cấy trên trứng gà có
phôi. Và cho đến nay Viện đã sản xuất 20 lô vacxin thành công. Trước khi đưa vào
sử dụng, vacxin cúm phải đạt được các tiêu chuẩn an toàn, miễn dịch cần thiết theo
quy định của Bộ Y tế Việt Nam và TCYTTG. Một trong số các tiêu chuẩn đó là
hàm lượng protein tổng số, formaldehyde và sucrose (đây là các tạp chất trong
vacxin thành phẩm có thể gây dị ứng, ung thư ). Với điều kiện trang thiết bị hiện
có, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu thẩm định quy trình phân tích
các chỉ tiêu hóa học trong vacxin cúm A/H1N1/09”, bao gồm:
 Xác định hàm lượng protein tổng số bằng phương pháp Lowry cải tiến.
9
 Xác định hàm lượng formaldehyde tự do bằng phương pháp đo quang với
thuốc thử acetylaceton.
 Bán định lượng sucrose bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC).
Mục tiêu của đề tài:
- Chứng minh được các quy trình phân tích đã nêu trên phù hợp với mục đích
ứng dụng để kiểm tra các chỉ tiêu hóa học tương ứng trong vacxin.
- Thông qua kết quả thẩm định các quy trình phân tích với đầy đủ dữ liệu thực
nghiệm.
- Góp phần hoàn thành mục tiêu lấy chứng chỉ GMP cho sản xuất và kiểm
định vacxin cúm trong năm 2011.
10
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tình hình bệnh cúm A/H1N1 và nghiên cứu sản xuất vacxin cúm
A/H1N1.
Dịch cúm A/H1N1 mới bùng phát lần đầu tiên tại Mehico vào cuối tháng
3/2009, đến tháng 4 lan nhanh sang Mỹ và các quốc gia lân cận. Theo dòng người
di chuyển, dịch cúm lan nhanh ra toàn thế giới. Tính đến ngày 7/3/2010, dịch cúm
A/H1N1 mới lan ra 213 nước và vùng lãnh thổ ở tất cả các châu lục, với 339.620
người mắc và 16713 người chết, hai nước có số người chết nhiều nhất là Mehico:
108 người và Mỹ: 44 người [11]. Như vậy sau 41 năm (đại dịch năm 1957 giết chết
2 triệu người), thế giới lại có một đại dịch cúm mới A/H1N1. Trước tình hình đó
TCYTTG (ngày 11/6/2009) đã nâng mức báo động dịch lên mức cao nhất 6/6 [11].
Vacxin phòng đại dịch cúm có công hiệu bảo vệ mạnh khi được tiêm trước
hoặc gần thời điểm dịch bùng phát. Vì vậy, cần chế tạo và sản xuất vacxin đặc hiệu
dành cho virus cúm A/H1N1/09 càng sớm càng tốt cũng như có những chiến dịch
tiêm phòng đúng lúc đúng chỗ khi đại dịch cúm xảy ra. Để đối phó hiệu quả với đại
dịch, WHO thúc đẩy việc sản xuất vacxin cúm ở các n ước đang phát triển bằng
hàng loạt giải pháp: Chuyển giao công nghệ, cấp kinh phí trợ cấp xây dựng cơ sở
sản xuất và đào tạo cán bộ, tổ chức các hội nghị bàn về việc thúc đẩy năng lực sản
xuất vacxin trên toàn thế giới [10]. Ngày 17/6/2009, Viện Vacxin và Sinh phẩm Y
tế (IVAC) đăng ký đề tài độc lập cấp nhà nước Nghiên cứu ứng dụng quy trình nuôi
cấy trên trứng gà có phôi để sản xuất vacxin cúm A/H1N1 mới. Trong năm 2010
Viện Vacxin và Sinh phẩm Y tế đã triển khai và hoàn thiện dây chuyền sản xuất
vacxin cúm tại trại Chăn nuôi Suối Dầu và sản xuất thử để ổn định quy trình 12 lô
vacxin cúm ở các quy mô khác nhau, trong đó có 5 lô hoàn thiện đến giai đoạn bán
thành phẩm [4].
11
1.2. Sản xuất vacxin cúm trên trứng gà có phôi.
1.2.1. Quy trình sản xuất và kiểm định vacxin cúm trên trứng gà có phôi.
Trứng gà sạch có phôi 10 đến 11 ngày tuổi được cấy chủng virus cúm. Sau
khi vào trong trứng, virus cúm sẽ nhân lên với số lượng lớn. Đến khi đủ số lượng,
tiến hành thu gặt dịch niệu nang. Dịch niệu nang được tinh chế sau đó hoàn nguyên
trong PBS và bất hoạt bằng formaldehyde, ly giải, lọc vô trùng để được nước cốt
pha bán thành phẩm. Sau đó, sản phẩm được đóng lọ tạo thành vacxin thành phẩm
[10].
Song song với quy trình sản xuất, quy trình kiểm định cũng diễn ra theo sơ
đồ 10:

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Bộ Y tế (2000), “Nguyên tắc “Thực hành tốt phòng kiểm nghiệm thuốc””,
Viện Vacxin và Sinh phẩm Y tế.
2. Bộ Y tế (2002), “Dược điển Việt Nam”, tập III, Nhà xuất bản Y học Hà Nội
2002.
3. Bộ Y tế (2002), “Hướng dẫn thực hành tốt sản xuất vacxin và sinh phẩm y
tế”, Viện Vacxin và Sinh phẩm Y tế.
4. Bộ Y tế (30/12/2010), “Báo cáo kết quả thực hiện nghị quyết hội nghị viên
chức – người lao động năm 2010”, Viện Vacxin và Sinh phẩm Y tế.
5. Cục Quản lý Dược (2010), “Tập huấn các văn bản quy phạm pháp luật về
dược mới được ban hành của Bộ Y tế”, Hà Nội
6. Đào Thị Thanh Vân (2007), “Nghiên cứu sản xuất kháng thể thỏ kháng
Ovalbumin dùng phát hiện Ovalbumin trong vacxin cúm A/H5N1”, Đồ án
Tốt nghiệp Đại học, Trường Đại học Nha Trang.
7. Đặng Văn Hòa (1996), “Giáo trình kiểm nghiệm thuốc”, nhà xuất bản Đại
học Y dược TP. Hồ Chí Minh.
8. Hội đồng Dược điển Việt Nam (năm 2009), “Dược điển Việt Nam”, Hà Nội.
9. Lê Văn Hiệp, Nguyễn Thị Minh Hiền, Lê Văn Bé, Nguyễn Thị Lan Phương,
Trần Ngọc Nhơn, Đặng Thị Hồng Vân, Viện Vacxin và sinh phẩm y tế Nha
Trang (2007), “Nghiên cứu sản xuất vacxin cúm A/H1N1 cho người trên
trứng gà có phôi từ chủng NIBRG – 14 tại Viện Vacxin”, Tạp chí Y học dự
phòng, tập XVII, số 5 (90) phụ bản, trang 52 – 56.
10. Lê Văn Hiệp (tháng 1/2011), “Quy trình tạo lô giống sản xuất X – 179A
(WSL) để sản xuất vacxin cúm A/H1N1/09”, Báo cáo kết quả nghiên cứu đề
tài cấp Bộ.
59
11. Lê Văn Hiệp (tháng 2/2011), “Ứng dụng quy trình nuôi cấy trên trứng gà có
phôi để sản xuất vacxin cúm A/H1N1”, Báo cáo kết quả nghiên cứu đề tài
cấp Bộ, Bộ Y tế.
12. Phạm Văn Ty (2004), “Miễn dịch học phân tử”, nhà xuất bản Đại học Quốc
Gia Hà Nội.
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
13. The European Pharmacopoeia (2001): Inactivated Influenza Vaccine (Whole
Virion).
14. US department of Health and Human Services Food and Drug
administration, Center for Drug Evaluation and research (CDER), Center for
veterinary Medicine (CVM) (2001) “Guidance for Industry – Bioanalytical
Method”, ppl – 20.
15. WHO (2010): “Egg – based influenza vaccine manufacturing”, Netherlands
Vaccine Institute.
16. WHO: The first draft of Recommendations for production and control of
Influenza Vaccine (Inactivated).
TÀI LIỆU INTERNET
17. http://***********/tag/tai-lieu/bài giảng hóa sinh.html.
18. http://en.wikipedia.org/wiki/Formaldehyde
19. http://www.sinhhocvietnam.com
20. http://www.tienphong.vn/San-xuat-vaccine-cum-AH1N.
21. http://bee.net.vn/9-dau-an-khoa-hoc-phai-nho-trong-nam-2009.