Thạc Sĩ Nghiên cứu tạo rễ tơ ở cây sâm dây (Đảng Sâm - Codonopsis sp) thông qua vi khuẩn Agrobacterium rhizo

LỜI MỞ ĐẦU
Sâm dây hay còn gọi là Đảng Sâm, là loài dây leo thảo, sống nhiều năm. Theo sách đỏ Việt Nam thì đẳng sâm là nguồn gen quý và là cây thuốc quý, được sử dụng phổ biến trong y học dân tộc. Sâm dây có tác dụng bổ ngũ tạng, nâng cao thể lực, tăng sức dẻo dai, tăng cường khả năng miễn dịch cho cơ thể; có tác dụng ích huyết, sinh tân dịch, chống mệt mỏi, giảm stress. Bộ phận dùng làm thuốc duy nhất của Đảng sâm là rễ. Rễ cây Đảng sâm chứa saponins, triterpenes và steroid. Các hoạt chất có trong Đảng Sâm giúp cho các hoạt động trao đổi chất của cơ thể tốt hơn. Về công dụng, Đảng sâm được dùng thay thế cho nhân sâm trong các bệnh thiếu máu, da vàng, bệnh bạch huyết, viêm thượng thận, nước tiểu có anbumin, hợp chân phù đau; dùng làm thuốc bổ dạ dày, chữa ho, tiêu đờm, lợi tiểu.Do có giá trị dược lý và kinh tế nên hiện nay người dân đang tập trung khai thác rễ cây sâm dây trong rừng một cách triệt để; làm cạn kiệt và giảm khả năng tái sinh nguồn cây trong tự nhiên.Vì vậy để bảo vệ nguồn cây dược liệu mang tính đặc hữu của các vùng cần có các hướng nghiên cứu bảo tồn, nhân giống, phát triển nguồn cây dược liệu này.
Rễ tơ là một bệnh ở thực vật được gây ra bởi quá trình tương tác giữa vi khuẩn A.rhizogenes và tế bào vật chủ. Đặc biệt rễ tơ là có thể sinh trưởng, phát triển tốt trên môi trường không cần bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng vì thế loại bỏ được dư lượng của các chất này trong sản phẩm tạo ra. Hơn nữa các rễ tơ có khả năng sinh trưởng nhanh, phân nhánh cao, kỹ thuật nuôi cấy và chuyển gen dễ dàng và có thể được nuôi cấy tạo sinh khối liên tục, điều này có ý nghĩa trong dây chuyền sản xuất các chất thứ cấp hay các dược phẩm sinh học tái tổ hợp. Vì vậy, việc chuyển từ trồng cả cây sang chỉ nuôi cấy rễ tơ để thu các hợp chất thứ cấp quan trọng được nghiên cứu phát triển rất nhanh do tiềm năng to lớn trong ngành công nghiệp dược. Ứng dụng công nghệ nuôi rễ tơ sẽ góp phần tạo nguồn dược liệu quý phục vụ sức khỏe cộng đồng và đóng góp cho công tác bảo tồn các cây dược liệu quý của Việt Nam.
Xuất phát từ cơ sở khoa học và nhu cầu thực tiễn trên chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu tạo rễ tơ ở cây sâm dây (Đảng Sâm - Codonopsis sp.) thông qua vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes” với nội dung bao gồm:
1) Xây dựng qui trình nhân nhanh in vitro cây sâm dây
2) Xây dựng qui trình chuyển gen tạo rễ tơ thông qua vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes
3) Nghiên cứu các điều kiện ảnh hưởng đến khả năng chuyển gen.
=========================
MỤC LỤC

LỜI MỞ ĐẦU 1
Chương 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1.Giới thiệu về cây sâm dây. 3
1.1.1.Phân loại 3
1.1.2.Đặc điểm hình thái 3
1.1.3.Giá trị dược liệu. 4
1.1.4.Tình hình nghiên cứu về sâm dây. 6
1.2. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật. 7
1.2.1. Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật. 7
1.2.2. Sự phát sinh hình thái thực vật. 8
1.3. Phương pháp chuyển gen tạo rễ tơ vào tế bào thực vật thông qua Agrobacterium rhizogenes 13
1.3.1. Giới thiệu về vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes và cơ chế chuyển gen. 13
1.3.2. Rễ tơ. 18
Chương 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 23
2.1. Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm . 23
2.1.1. Thời gian. 23
2.1.2. Địa điểm . 23
2.2. Vật liệu. 23
2.2.1. Nguồn mẫu. 23
2.2.2. Trang thiết bị thí nghiệm . 23
2.2.3. Môi trường. 24
2.2.4. Điều kiện nuôi cấy. 24
2.3. Nội dung thí nghiệm . 24
2.3.1. Tạo nguyên liệu cho quá trình chuyển gen. 24
2.3.2. Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình chuyển gen tạo rễ tơ cây sâm dây 27
2.4. Phương pháp nghiên cứu. 28
2.4.1. Cách bố trí thí nghiệm . 28
2.4.2. Sử dụng phương pháp nuôi cấy mô hiện hành. 28
2.4.3. Quy trình chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes. 29
2.5. Các chỉ tiêu theo dõi 30
2.6. Phương pháp xử lý số liệu. 31
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32
3.1. Tạo nguyên liệu cho quá trình chuyển gen. 32
3.1.1. Thí nghiệm A1: Ảnh hưởng của BAP và NAA đến khả năng tạo chồi của cây sâm dây 32
3.1.2. Thí nghiệm A2: Ảnh hưởng của 2,4D và TDZ đến khả năng tạo mô sẹo. 34
3.1.3. Thí nghiệm A3: Ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ. 37
3.1.4. Ra cây và chăm sóc cây. 39
3.2. Chuyển gen tạo rễ tơ cây sâm dây. 40
3.2.1. Thí nghiệm B1: Ảnh hưởng của các loại nguyên liệu đến khả năng chuyển gen tạo rễ tơ. 40
3.2.2. Thí nghiệm B2: Ảnh hưởng của mật độ khuẩn OD đến khả năng tạo rễ tơ. 44
3.2.3. Thí nghiệm B3: Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến khả năng chuyển gen tạo rễ tơ 45
Chương 4 : KẾT LUẬN 47
4.1. Kết luận :. 47
4.2. Đề nghị 47
TÀI LIỆU THAM KHẢO 48