Thạc Sĩ Nghiên cứu tạo phát sinh phôi soma từ phôi non một số dòng thông nhựa Pinus merkusii Jungh. et de Vr

MỞ ĐẦU

Thông nhựa hay còn gọi là thông hai lá có tên khoa học là Pinus merkusii Jungh. et de Vriese, là một trong số ít những loài thông nhiệt đới trên thế giới. Thông nhựa phân bố nhiều ở vùng Đông Nam Á, trong đó có Việt Nam. Thông nhựa chủ yếu được trồng để lấy nhựa phục vụ một số ngành công nghiệp như sơn, sản xuất nhựa đường. Nhựa thông được tinh chế để thu tinh dầu thông, phần còn lại là Colophan được xà phòng hóa để làm xà phòng, làm keo trong sản xuất giấy và một số ứng dụng trong công nghiệp điện, làm chất đốt v.v Ngoài ra, gỗ thông còn được dùng trong xây dựng, đóng đồ gia dụng. Thông nhựa có thể sống ở những vùng đồi trọc, đất đai khô cằn, nghèo dinh dưỡng nên được trồng để cải tạo môi trường và chống xói mòn đất.
Ở Việt nam, thông nhựa được trồng nhiều ở một số tỉnh như Quảng Ninh, Quảng Bình, Nghệ An, Hà Tĩnh và Lâm Đồng Tuy nhiên, trong mấy năm gần đây (từ 2005-2007) rừng thông nhựa bị tấn công bởi nhiều loài sâu bệnh, đặc biệt là sâu róm, gây thiệt hại rất lớn về kinh tế. Vì vậy, việc tuyển chọn, lai tạo để tìm ra giống thông nhựa có khả năng chống chịu cao với sâu bệnh, nhất là sâu róm đang là yêu cầu cấp thiết của sản xuất.
Hiện nay, việc nghiên cứu tạo chọn giống thông nhựa kháng sâu bệnh được tiến hành chủ yếu là phương pháp truyền thống nên tốn rất nhiều thời gian để đưa một giống mới vào sản xuất.
Với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, đặc biệt là công nghệ sinh học thực vật đã đạt được những thành tựu quan trọng trong việc cải tạo giống cây trồng. Cụ thể, ở Canada người ta đã tạo được giống thông có khả năng chống chịu cao với sâu ăn lá bằng cách bắn gen Bt vào loài Pinus strobus (Lachance và ctv 2007). Tuy nhiên, để áp dụng kỹ thuật chuyển gene, một bước không thể thiếu được đó là xây dựng hệ thống tái sinh in vitro vật liệu dự kiến chuyển gene. Các tài liệu đã công bố trên thế giới cho thấy ở chi thông, phần lớn kết quả chuyển gene thành công đều được tiến hành trên vật liệu là thể tiền phôi soma.
Vì thế, để đạt được mục tiêu là tạo được giống thông nhựa kháng sâu róm bằng kỹ thuật chuyển gen, việc nghiên cứu hệ thống tái sinh in vitro thông qua con đường tạo phôi soma là hết sức cần thiết. Tuy nhiên, hiện nay ở Việt Nam, chưa có bất cứ một công trình nào được công bố về hướng nghiên cứu này, vì thế, đề tài : “ Nghiên cứu tạo phát sinh phôi soma từ phôi non một số dòng thông nhựa Pinus merkusii Jungh. et de Vriese ” được đề xuất nhằm tạo được nguồn vật liệu cho ứng dụng kỹ thuật chuyển gene Bt để tạo cây thông nhựa kháng sâu róm trong tương lai. Mặt khác, kỹ thuật tạo phôi soma còn là một kỹ thuật nhân giống mới nhằm tạo ra hàng loạt cây con với số lượng lớn và có thể áp dụng trên quy mô công nghiệp.
Mục tiêu đề tài: xây dựng được kỹ thuật tạo phát sinh phôi soma hiệu quả nhằm cung cấp nguồn vật liệu cho các nghiên cứu chuyển gene và nhân giống vô tính thông nhựa.

MỤC LỤC

Trang tựa .
Lời cảm ơn .
Mục lục i
Danh mục chữ viết tắt v
Danh mục bảng . .vi
Danh mục hình . vi
Danh mục ảnh vii
Mở đầu 1
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1 Giới thiệu về chi Pinus 3
1.1.1 Phân loại Pinus merkusii 3
1.1.2 Phân bố 4
1.1.3 Đặc điểm sinh học 4
1.1.4 Giá trị kinh tế . 5
1.1.5 Con đường sinh sản ở thông nhựa 6
1.2 Phôi soma và quá trình hình thành phôi soma . 7
1.2.1 Sơ lược về phôi soma. 7
1.2.2 Sự phát sinh phôi soma . 8
1.2.3 Sơ lược quá trình nghiên cứu phôi soma 10
1.3 Tiềm năng phát sinh phôi soma 10
1.4 Các giai đoạn phát triển của phôi . 11
1.4.1 Sự phát sinh phôi hữu tính 11
ii
ii
1.4.1.1 Điều hòa sự phát triển của phôi . 11
1.4.1.2 Thiết lập chương trình phát sinh phôi 11
1.4.2 Các giai đoạn của sự phát sinh phôi 12
1.4.2.1 Các bước tạo phôi vô tính 13
1.4.2.1.1 Nuôi cấy tạo phôi 13
1.4.2.1.2 Nuôi cấy tăng sinh phôi 15
1.4.2.1.3 Giai đoạn tiền trưởng thành của phôi . 15
1.4.2.1.4 Sự phát triển của phôi . 15
1.4.2.2 Xây dựng bản đồ phát triển của phôi ở thực vật hạt trần 16
1.5 Một số giả thuyết trong quá trình phát sinh phôi soma 18
1.6 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phát sinh phôi soma 19
1.6.1 Nhân tố tác động đến quá trình cảm ứng . 19
1.6.2 Nhân tố tác động đến sự gia tăng số lượng phôi . 21
1.6.2.1 Chất điều hòa sinh trưởng thực vật và nitơ khử 22
1.6.2.2 Kiểu di truyền thực vật 22
1.6.3 Nhân tố ảnh hưởng đến sự biệt hóa mô . 22
1.7 Ứng dụng của quá trình tạo phôi soma 23
Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 25
2.1 Đối tượng nghiên cứu 25
2.2 Nội dung nghiên cứu 25
2.3 Vật liệu nghiên cứu 27
2.4 Phương pháp nghiên cứu .27
2.4.1 Thu quả non và xử lý vô trùng 27
2.4.2 Phương pháp cảm ứng tạo khối tiền phôi . 27
2.4.3 Nghiên cứu sự tăng sinh của khối tiền . 28
2.4.4 Nghiên cứu sự trưởng thành của phôi . 28
2.4.5 Phương pháp quan sát hình thái phôi 28
2.4.6 Phương pháp sinh trắc nghiệm đo lượng hocmon nội sinh 28
2.4.7 Phương pháp đo cường độ hô hấp 30
2.5 Môi trường nuôi cấy . 30
2.5.1 Môi trường cảm ứng . 30
2.5.2 Môi trường duy trì và tăng sinh khối 31
2.5.3 Môi trường trưởng thành 31
2.6 Bố trí thí nghiệm 31
2.7 Các chỉ tiêu theo dõi và xử lý số liệu . 31
Chương 3: Kết quả và thảo luận 34
3.1 Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến quá trình cảm ứng tạo khối tiền
phôi . 38
3.2 Cấu trúc hình thái trong quá trình cảm ứng tạo thể phát sinh phôi 38
3.3 Ảnh hưởng của nước dừa đến các biến đổi hình thái và giai đoạn nhân nhanh . 39
3.4 Thí nghiệm ảnh hưởng của Glutamin đến các biến đổi hình thái và giai đoạn nhân
nhanh khối sinh phôi 3
3.5 Thí nghiệm Ảnh hưởng của đường maltose và sucrose lên sự tăng sinh khối của
PEM . 47
3.6 Quan sát cấu trúc hình thái của khối phát sinh phôi trong quá trình phát triển . 49
3.7 Ảnh hưởng của nồng độ ABA đến cấu trúc hình thái và tỷ lệ tạo phôi thành thục
hóa 50
3.8 Các giai đoạn của quá trình phát sinh phôi soma 51
3.9 Kết quả đo cường độ hô hấp 54
3.10 Sự thay đổi hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong quá trình nuôi cấy
55
iv
iv
Chương 4:
KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ .57
TÀI LIỆU THAM KHẢO 59
PHỤ LỤC