Luận Văn Nghiên cứu tạo mô sẹo phôi hoá và phôi vô tính từ nuôi cấy noãn ở một số giống cây ăn quả có múi

I. Đặt vấn đề:
Hiện nay, nuôi cấy mô sẹo phôi hoá (ký hiệu EC -embryogenic callus) là một kỹ thuật cơ bản trong tạo giống citrus. Callus phôi hoá đã được sử dụng trong nhiều nghiên cứu khác nhau như tạo giống sạch bệnh, nghiên cứu phát sinh hình thái phôi vô tính, nhân sinh khối tế bào dịch lỏng, nuôi cấy và dung hợp tế bào trần để tạo giống lai tứ bội thể (Grosser et al, 2000), nghiên cứu chuyển gen và bảo quản nguồn gen (Kunitake and Mu, 1995).Tái sinh cây từ mô sẹo phôi hoá ở các giống cam, Grosser và cộng sự đã tạo ra nhiều dạng đột biến ổn định, như chín sớm hoặc muộn hơn, không hạt, chất lượng được nâng cao (Grosser et al., 2000). Để tạo callus phôi hoá có nguồn gốc từ phôi tâm (Nucellar) in vitro ở citrus người ta có thể nuôi cấy noãn đã thụ tinh hoặc chưa thụ tinh. Callus phôi hoá còn được tạo ra khi nuôi cấy các hạt lép của quả chín từ 8 đến 15 tháng tuổi kể từ khi hoa tung phấn (Starrantino and Russo, 1980). Ngoài ra callus phôi hoá đã được tạo ra từ nuôi cấy mô hoặc cơ quan khác như từ bao phấn (Hidaka and Omura, 1989), từ chân nhuỵ cái (Style) ở chanh tây (Limon). Carimi và cộng sự đã nghiên cứu nuôi cấy đầu nhuỵ cái (Stigma) và chân nhị cái (Style) của nhiều giống citrus khác nhau để tạo callus phôi hoá và tái sinh cây (Carimi et al., 1995; De Pasquale et al. 1994). Kết quả cho thấy các loài C.limon, C.medica và Cam ngọt cho kết quả tạo callus và tái sinh phôi tốt nhất.
Mục tiêu nghiên cứu của chúng tôi là xây dựng quy trình tạo nguồn mô sẹo phôi hoá, từ đó tạo phôi vô tính và tái sinh cây phục vụ cho nghiên cứu chọn tạo giống không hạt và vật liệu cho nghiên cứu chuyển gen trong tương lai.

II. Nguyên liệu và phương pháp:
a/ Nguyên liệu:
Các giống cây ăn quả có múi địa phương và nhập nội khác nhau như: Bưởi Phúc Trạch (Citrus grandis), Cam Vân Du, Olinda Valencia, Navel, Cam Sành (C. nobilis), Quýt Chum, Quýt Đường canh (C. reticulata) và quýt lai Murcott đã được sử dụng trong nghiên cứu. Mẫu nuôi cấy: noãn trước và sau thụ phấn ở các độ tuổi khác nhau (từ 1 đến 8 tuần tuổi). Cách làm như sau: Bầu nhuỵ lấy nuôi cấy một ngày trước khi hoa nở. Sau khi hoa được thụ phấn, nhuỵ cái rụng, bầu nhuỵ phát triển thành quả non. Quả non của các giống trên được thu hái ở 1, 2, 3, đến 8 tuần tuổi kể từ sau khi hoa tung phấn. Từ bầu nhuỵ cái và quả non đã được khử trùng, tách lấy noãn (noãn sau thụ phấn phát triển thành hạt non) để nuôi cấy trên các môi trường khác nhau. Noãn được nuôi cấy trên đĩa Petri, mỗi đĩa chứa 16 noãn. Mỗi lô thí nghiệm với 60 quả hoặc bầu nhuỵ. Riêng với quả non có độ tuổi 6, 7, 8 tuần, chúng tôi tiến hành tách bỏ vỏ lụa ở bên ngoài của hạt non, sau đó tách loại bỏ phôi non rồi mới cấy vào đĩa môi trường. Tất cả các thao tác trên được thực hiện dưới kính hiển vi soi nổi.