Tiến Sĩ Nghiên cứu tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu kháng nguyên CYFRA21-1 nhằm phát triển KIT chẩn đoán un

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
NĂM 2013


MỤC LỤC
Mục Tên chương, phần, mục và tiểu mục Trang
Lời cảm ơn i
Lời cam đoan ii
Danh mục chữ viết tắt vi
Danh mục hình ix
Danh mục bảng xii
Mở đầu 1
Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
1.1. Nguồn gốc và đặc điểm ung thư 4
1.1.1. Nguồn gốc tế bào ung thư 4
1.1.2. Đặc điểm của tế bào ung thư 6
1.1.3 Ung thư phổi 7
1.2. Kháng nguyên CYFRA21-1 12
1.2.1. Cytokeratin 12
1.2.2. Cấu trúc của Cytokeratin 15
1.2.3. Biểu hiện của Cytokeratin 15
1.2.4. Kháng nguyên CYFRA21-1 17
1.3. Kháng thể 21
1.3.1. Một số kháng thể đang được sử dụng trong nghiên cứu và thực tiễn hiện nay21
1.3.2. Các nghiên cứu về kháng thể đặc hiệu CYFRA21-1 29
1.4. Công nghệ phage display 30
1.4.1. Giới thiệu công nghệ phage display 30
1.4.2. Ứng dụng của kháng thể phage-scFv trong chẩn đoán và điều trị31

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33
2.1. Vật liệu 33
2.1.1. Mẫu bệnh phẩm 33
2.1.2. Sinh phẩm và hóa chất 33
2.1.3. Trang thiết bị 35
2.1.4. Phần mềm máy tính 36
2.2. Phương pháp 37
2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu 37
2.2.2. Các phương pháp thao tác với DNA 38
2.2.3. Các phương pháp thao tác với protein tái tổ hợp 45
2.2.4. Các kỹ thuật phage display 48

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 55
3.1. Tách dòng và xác định trình tự đoạn gen mã hóa kháng nguyên CYFRA21-1
3.1.1. Tách RNA tổng số từ máu bệnh nhân ung thư phổi 55
3.1.2. Nhân bản đoạn gen mã hoá kháng nguyên CYFRA21-1 57
3.1.3. Tách dòng đoạn gen mã hóa kháng nguyên CYFRA21-1 58
3.1.4. Xác định trình tự đoạn gen cDNA mã hóa CYFRA21-1 62
3.2. Biểu hiện và thu kháng nguyên CYFRA21-1 64
3.2.1. Nhân bản vùng mã hóa epitope kháng nguyên CYFRA21-1 64
3.2.2. Tách dòng đoạn gen mã hóa vùng epitope kháng nguyên CYFRA21-1
3.2.3. Thiết kế vector biểu hiện pET-21a(+)/Cyfra21-1 67
3.2.4. Biểu hiện protein CYFRA21-1 tái tổ hợp 72
3.2.5. Tinh sạch kháng nguyên CYFRA21-1 74
3.2.6. Kết quả phân tích khối phổ protein tái tổ hợp 75
3.3. Gây miễn dịch gà bằng kháng nguyên CYFRA21-1 77
3.4. Thu nhận kháng thể đặc hiệu kháng nguyên CYFRA21-1 81
3.4.1. Tách chiết RNA tổng số từ tủy xương và lách của gà đã được gây miễn dịch 81
3.4.2. Nhân bản đoạn gen mã hóa vùng biến đổi của kháng thể gà đặc hiệu epitope kháng nguyên CYFRA21-1
3.4.3. Quy trình tạo dòng phage biểu hiện kháng thể scFv (kháng thể phage)
3.4.4. Kết quả chọn dòng kháng thể phage-scFv đặc hiệu kháng nguyên CYFRA21-1
3.4.5. Xác định trình tự gen mã hóa kháng thể đặc hiệu epitope kháng nguyên CYFRA21-1
3.5. Sử dụng kháng thể phage-scFv kháng CYFRA21-1 thu được để định lượng kháng nguyên CYFRA21-1
3.6. Kết quả định lượng CYFRA21-1 trong các mẫu bệnh phẩm do bệnh viện Bạch Mai cung cấp

KẾT LUẬN & KIẾN NGHỊ 101
NHỮNG CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ
LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI102
TÀI LIỆU THAM KHẢO 103

MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Ung thư phổi (UTP) là một trong những căn bệnh hiểm nghèo do sự tăng sinh không bình thường của tế bào, thường gặp ở nam giới, chủ yếu là lứa tuổi 50-70, đặc biệt liên quan đến những người đã hoặc đang hút thuốc lá.
Đồng thời, UTP cũng là căn bệnh có tỉ lệ tử vong lớn thường gặp ở người. Vì vậy, việc phát hiện sớm UTP có ý nghĩa sống còn với bệnh nhân.
Thực tế, trong y học đã có rất nhiều phương pháp được sử dụng để chẩn đoán UTP (sinh thiết phổi, nội soi phổi, thử đờm, chọc nước màng phổi,chụp quang tuyến cắt lớp ) và một số phương pháp điều trị UTP (hoá trị liệu, phẫu thuật, xạ trị ) [2]. Tuy nhiên, khi phát hiện UTP thì thường đã muộn hoặc quá muộn, vì một số căn bệnh khác (viêm phế quản, viêm phổi, lao, ) cũng có những triệu chứng tương tự UTP. Do vậy, việc tìm kiếm các phương pháp hữu hiệu có độ chính xác cao để chẩn đoán sớm UTP đang là vấn đề cần thiết và cấp bách của các nhà khoa học, y học trong và ngoài nước. Nghiên cứu tế bào ung thư cũng như nguồn gốc và sự phát triển của tế
bào ung thư, người ta nhận thấy ung thư có liên quan chặt chẽ với sự xuất hiện hàm lượng các kháng nguyên đặc trưng ung thư trong máu, nước mô, huyết thanh [12], [21], [22], [85], [86], [95]. Điều này đã mở ra hướng nghiêncứu mới trong chẩn đoán và điều trị ung thư trên thế giới và trong nước.
Một trong những hướng nghiên cứu đó là phương pháp sử dụng các chỉ thị kháng nguyên để xác định, chẩn đoán bệnh và tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu với kháng nguyên đích để định hướng điều trị ung thư nói chung, UTP nói riêng [51], [58], [88], [102]. Phương pháp này bắt đầu được nghiên cứu sâu hơn vào những năm cuối của thế kỷ trước. Đến nay, vấn đề này đang được sự quan tâm đặc biệt của các nhà khoa học trên thế giới và trong nước. Phương pháp sử dụng chỉ thị kháng nguyên, tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu kháng nguyên không chỉ áp dụng trong chẩn đoán và điều trị ung thư mà còn được ứng dụng mạnh mẽ trong chẩn đoán và điều trị nhiều bệnh nan y khác như AIDS, viêm gan B
Hiện nay, nhiều chỉ thị kháng nguyên ung thư được biết đến và có thể sử dụng để phát hiện ung thư như: CEA, NES, CA125, CYFRA21-1, HER- 2/neu [38], [47], [52], [66], [73] trong đó, kháng nguyên CYFRA21-1 là một chỉ thị điển hình cho bệnh UTP dạng không phải tế bào nhỏ (non small cell lung carcinoma – NSCLC) do sự tăng hàm lượng CYFRA21-1 nhanh chóng trong dịch cơ thể khi tế bào biểu mô phổi tăng sinh bất thường [14], [16], [24], [25], [39]. Vì vậy, nếu phát hiện sớm được sự tăng hàm lượng CYFRA21-1 trong dịch cơ thể sẽ góp phần chẩn đoán sớm được UTP. Do đó, kháng nguyên CYFRA21-1 có thể được sử dụng như là một chỉ thị đặc hiệu để chẩn đoán sớm, từ đó định hướng điều trị hiệu quả UTP dạng NSCLC. Trên thế giới, hiện nay một số công trình nghiên cứu của Suzuki và
cộng sự (2007) [89]; Tomita và cộng sự (2010) [94]; Yang và cộng sự (2012) [107] . đã cho thấy, hàm lượng CYFRA21-1 trong cơ thể luôn được duy trì vào khoảng 3,3 ng/ml, tuy nhiên hàm lượng này tăng đột biến khi có sự tăng sinh không bình thường của tế bào biểu mô phế quản. Mặt khác, lượng kháng thể kháng CYFRA21-1 được sản xuất ra chưa nhiều và chưa đáp ứng được nhu cầu chẩn đoán, điều trị bệnh. Do đó, kháng thể đặc hiệu kháng nguyên CYFRA21-1 được một số công ty thương mại hóa trên thị trường với giá thành tương đối cao, điều này đã gây ra không ít khó khăn cho người sử dụng.
Tại Việt Nam, đây là vấn đề còn chưa được nghiên cứu nhiều, hiện tại các nhà khoa học Việt Nam vẫn đang tích cực trên đường nghiên cứu về kháng thể tái tổ hợp phục vụ cho nhu cầu chẩn đoán và điều trị bệnh. Do vậy, việc nghiên cứu tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu kháng nguyên CYFRA21-1 trong UTP là một trong những hướng nghiên cứu mới nhằm chẩn đoán, theo dõi và định hướng điều trị kịp thời bệnh UTP dạng NSCLC, góp phần vào những thành tựu đáng kể trong y học và sinh học. Từ những lý do trên, chúng tôi chọn thực hiện đề tài luận án “Nghiên cứu tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu kháng nguyên CYFRA21-1 nhằm phát triển KIT chuẩn đoán ung thư phổi”.

2. Mục tiêu của đề tài
Tạo được kháng thể scFv kháng kháng nguyên CYFRA21-1 biểu lộ trên phage để phát triển KIT chẩn đoán sớm UTP dạng NSCLC.
3. Nội dung nghiên cứu
- Tách dòng và xác định trình tự đoạn gen cDNA mã hóa kháng nguyên CYFRA21-1 từ bệnh phẩm UTP.
- Thu nhận, biểu hiện và tinh sạch kháng nguyên CYFRA21-1.
- Gây miễn dịch động vật thí nghiệm bằng kháng nguyên tái tổ hợp thu nhận được.
- Tạo dòng phage biểu lộ kháng thể scFv kháng CYFRA21-1.
- Sàng lọc kháng thể scFv biểu lộ trên phage kháng CYFRA21-1.
- Sử dụng kháng thể tái tổ hợp thu được để bước đầu xây dựng KIT chẩn đoán UTP.