Thạc Sĩ Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp STAPHYLOCOCCAL ENTEROTOXIN B ( SEN) dạng không độc từ đoạn GE

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/

MỤC LỤC
Trang
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT i
DANH MỤC HÌNH iii
DANH MỤC BẢNG . v
MỞ ĐẦU . 1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 3
1.1. Ngộ độc thực phẩm do tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) . 3
1.1.1. Trên thế giới 3
1.1.2. Tại Việt Nam 6
1.2. Giới thiệu về Staphylococcus aureus . 8
1.2.1. Phân loại 8
1.2.2. Hình thái, đặc điểm sinh hóa . 8
1.2.3. Các độc tố của Staphylococcus aureus . 11
1.3. Độc tố ruột Staphylococcal enterotoxin B 15
1.3.1. Đặc điểm cấu trúc . 15
1.3.2. Cơ chế gây độc 16
1.3.3. Những triệu chứng thường gặp . 17
1.3.4. Các phương pháp phát hiện S. aureus và SEB 17
1.3.5. Protein tái tổ hợp SEB và tiềm năng ứng dụng . 21
1.4. Hệ biểu hiện gen 23
1.4.1. Hệ biểu hiện E. coli . 23
1.4.2. Chủng biểu hiện E. coli BL21(DE3) 24
1.4.3. Vector biểu hiện pET22b(+) 25 Luận văn thạc sỹ sinh học Nguyễn Thị Hoài Thu

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 26
2.1. Vật liệu, trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu . 26
2.1.1. Vật liệu . 26
2.1.2. Hóa chất 26
2.1.3. Môi trường nuôi cấy 28
2.1.4. Thiết bị máy móc . 28
2.2. Các phương pháp nghiên cứu 28
2.2.1. Tách chiết DNA tổng số . 28
2.2.2. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) 29
2.2.3. PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (Colony – PCR) . 30
2.2.4. Tách dòng bằng vector pJET1.2/blunt 30
2.2.5. Xác định trình tự acid nucleic . 31
2.2.6. Tạo đột biến điểm định hướng theo phương pháp Mega-primer 31
2.2.7. Phản ứng nối ghép gen 32
2.2.8. Phương pháp biến nạp DNA plasmid vào tế bào khả biến Escherichia coli
. 33
2.2.9. Phương pháp tách chiết DNA plasmid 33
2.2.10. Cắt plasmid bằng enzym giới hạn . 34
2.2.11. Tinh sạch phân đoạn DNA 34
2.2.12. Phương pháp biểu hiện gen đích trong chủng E. coli BL21(DE3) . 35
2.2.13. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose . 35
2.2.14. Phương pháp điện di protein trên gel polyacrylamide . 36
2.2.15. Phương pháp tinh sạch protein tái tổ hợp . 37
2.2.16. Phương pháp định lượng protein theo phương pháp Bradford 38 Luận văn thạc sỹ sinh học Nguyễn Thị Hoài Thu

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/

2.2.17. Phương pháp kiểm tra độc tính của protein tái tổ hợp . 38
2.2.18. Phương pháp Western blot 40
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42
3.1. Tách chiết DNA tổng số S. aureus và nhân dòng gen seb 42
3.1.1. Tách chiết DNA tổng số S. aureus . 42
3.1.2. Nhân dòng gen seb 42
3.1.3. Xác định trình tự gen seb . 44
3.2. Tạo đột biến điểm trên gen seb 45
3.2.1. Tạo gen seb đột biến 45
3.2.2. Xác định trình tự gen seb đột biến . 47
3.3. Thiết kế vector biểu hiện pET22b(+) mang gen seb đột biến . 48
3.3.1. Thiết kế vector pET22(b+) mang gen seb đột biến . 48
3.3.2. Giải trình tự gen seb đột biến trên vector biểu hiện . 49
3.4. Tối ưu các điều kiện biểu hiện gen seb đột biến trong tế bào E. coli BL21 và
tinh sạch protein mtSEB . 50
3.4.1. Biểu hiện gen seb đột biến trong tế bào E. coli BL21 . 50
3.4.2. Tối ưu các điều kiện biểu hiện gen seb đột biến . 51
3.4.3. Tinh sạch ptotein tái tổ hợp mtSEB . 55
3.4.4. Xác định hàm lượng protein mtSEB theo phương pháp Bradford 57
3.5. Đánh giá tính kháng nguyên của protein mtSEB 58
3.6. Đánh giá độc tính của protein mtSEB trên động vật thử nghiệm 58
3.6.1. Đánh giá độc tính giữa protein wtSEB và mtSEB ở liều tiêm 1xLD 50 và lô
đối chứng . 58
3.6.2. Đánh giá độc tính giữa protein wtSEB và mtSEB ở liều tiêm 3xLD 50 60
3.6.3. Đánh giá độc tính giữa protein wtSEB và mtSEB ở liều tiêm 10xLD 50 61 Luận văn thạc sỹ sinh học Nguyễn Thị Hoài Thu

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/

KẾT LUẬN . 63
KIẾN NGHỊ 63
TÀI LIỆU THAM KHẢO . 64
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 75
Luận văn thạc sỹ sinh học Nguyễn Thị Hoài Thu

K16 – Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật i

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
µl Microliter
APS Ammonium persulphate
bp Base pair
BSA Bovine serum albumin
dH 2 O Nước khử ion
DNA Deoxyribonucleic acid
DNase Deoxyribonuclease
dNTP Deoxyribonucleotide
EDTA Ethylene Diamine Tetraacetace Axit
IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid
Kb Kilobase
kDa Kilo Dalton
LB Luria - Bertani
LD 50 Lethal dose, 50%
ml Milliliter
mtSEB Mutant SEB
OD Optical density
PBS Phosphate buffer saline
PCR Polymerase Chain Reaction
RNA Ribonucleic Acid
S. aureus Staphylococcus aureus
SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Luận văn thạc sỹ sinh học Nguyễn Thị Hoài Thu

K16 – Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật ii

SEB Staphylococcal enterotoxin B
SEs Staphylococcal enterotoxins
TAE Tris-acetate-EDTA
Taq Thermus aquaticus
TE Tris EDTA
TEMED N,N,N ,N -Tetramethylethylenediamine
v/p Vòng/phút
v/v volume/volume
w/v Weight/volume
wtSEB Wild type SEB













Luận văn thạc sỹ sinh học Nguyễn Thị Hoài Thu

K16 – Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật iii

DANH MỤC HÌNH
Tên hình Trang
Hình 1.1. Hình ảnh các vi khuẩn S. aureus dưới kính hiển vi điện tử 9
Hình 1.2. Các yếu tố gây bệnh của S. aureus 13
Hình 1.3. Cấu trúc tinh thể của protein SEB 15
Hình 1.4. Cơ chế gây độc của siêu kháng nguyên 16
Hình 3.1. Điện di đồ sản phẩm DNA tổng số của chủng S. aureus 42
Hình 3.2. Điện di đồ sản phẩm khuếch đại gen seb từ DNA tổng số của S.
aureus
43
Hình 3.3. Điện di đồ plasmid mang gen seb được tách chiết từ thể biến nạp 43
Hình 3.4. Điện di đồ sản phẩm cắt pJET1.2/seb bằng enzym hạn chế EcoRI và
HindIII.
44
Hình 3.5. Trình tự gen seb của chủng S. aureus 44
Hình 3.6. Quy trình tạo đột biến H12Y trên gen seb 46
Hình 3.7. Điện di đồ sản phẩm PCR trên gel agarose 1 % 47
Hình 3.8. Trình tự amino acid sai khác giữa dòng đột biến (mtSEB) và dòng
chưa đột biến (wtSEB)
47
Hình 3.9. Điện di đồ sản phẩm PCR trực tiếp từ khuẩn lạc để chọn dòng mang
plasmid tái tổ hợp pET22(b+)/mtSEB
48
Hình 3.10. Điện di đồ DNA plasmid tái tổ hợp cắt bằng enzym EcoRI,
HindIII
49
Hình 3.11. So sánh trình tự nucleotide của wtSEB và mtSEB 50
Hình 3.12. Protein tổng số từ chủng tái tổ hợp E. coli BL21 (DE3) sau 5 giờ
cảm ứng
51
Hình 3.13. Protein tổng số từ chủng E. coli BL21 mang gen mã hóa mtSEB
được nuôi cấy cảm ứng ở các nhiệt độ khác nhau
52 Luận văn thạc sỹ sinh học Nguyễn Thị Hoài Thu

K16 – Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật iv

Hình 3.14. Khả năng sinh tổng hợp mtSEB của chủng E. coli tái tổ hợp với
nồng độ chất cảm ứng IPTG khác nhau sau 5 giờ cảm ứng
54
Hình 3.15. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cảm ứng lên hàm lượng protein
SEB
54
Hình 3.16. Protein mtSEB sau khi tinh chế bằng cột ái lực Ni-NTA trên gel
SDS-PAGE
56
Hình 3.17. Đồ thị đường chuẩn định lượng protein bằng BSA có phương trình
tuyến tính: Y = 0,456X
57
Hình 3.18. Phân tích khả năng bắt cặp đặc hiệu của kháng nguyên tái tổ hợp
với kháng thể kháng lại SEB của S. aureus
58
Hình 3.19. Kết quả tiêm chuột ở lô 2 với liều tiêm 1xLD 50 sau 7 ngày theo dõi 60
Hình 3.20. Kết quả tiêm chuột ở lô 3 với liều tiêm 3xLD 50 sau 7 ngày theo dõi 61
Hình 3.21. Kết quả tiêm chuột ở lô 4 với liều tiêm 10xLD 50 sau 7 ngày theo
dõi
62











Luận văn thạc sỹ sinh học Nguyễn Thị Hoài Thu

K16 – Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật v

DANH MỤC BẢNG
Tên bảng Trang
Bảng 1.1. Các độc tố của S. aureus 11
Bảng 2.1. Các mồi sử dụng 26
Bảng 2.2. Thành phần các loại đệm và dung dịch 27
Bảng 2.3. Thành phần PCR 29
Bảng 2.4. Chu trình nhiệt của các PCR 30
Bảng 2.5. Thành phần gel cô và gel tách 36
Bảng 3.1. Độ tương đồng của gen seb ở chủng S. aureus nghiên cứu với một
số chủng vi khuẩn trên ngân hàng gen thế giới (NCBI)
45
Bảng 3.2. Kết quả đo độ hấp thụ BSA ở bước sóng 595nm 57
Bảng 3.3. So sánh số chuột chết sau tiêm dung dịch wtSEB, mtSEB ở liều
tiêm 1xLD 50
59
Bảng 3.4. So sánh số chuột chết sau tiêm dung dịch wtSEB, mtSEB ở liều
tiêm 3xLD 50
60
Bảng 3.5. So sánh số chuột chết sau tiêm dung dịch wtSEB, mtSEB ở liều
tiêm 10xLD 50
61
Luận văn thạc sỹ sinh học Nguyễn Thị Hoài Thu

K16 – Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 1

MỞ ĐẦU
Ngộ độc thực phẩm là hiện tượng đau bụng, nôn mửa, nóng sốt, tiêu chảy của
người do ăn phải thức ăn không đảm bảo vệ sinh hoặc bị hư hỏng. Có nhiều nguyên
nhân dẫn đến thực phẩm không an toàn, nhiễm vi khuẩn là một trong những nguyên
nhân phổ biến gây bệnh trên toàn cầu. Tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus – S.
aureus) là một trong những nguyên nhân chính gây ngộ độc thực phẩm do chúng tiết
ra các độc tố ruột staphylococcal enterotoxins (SEs). Độc tố của tụ cầu vàng được xếp
vào họ những siêu kháng nguyên, chúng có tính ổn định cao, kháng với hầu hết các
enzym phân hủy protein và vì thế chúng giữ được hoạt tính trong đường tiêu hóa sau
khi được ăn vào bụng. Chúng còn kháng với chymotrypsine, rennin và papain. Đặc
biệt, tính bền nhiệt là một trong những tính chất quan trọng nhất của các SE trong lĩnh
vực an toàn thực phẩm. Chúng không bị phân hủy ở 100 o C trong 30 phút, thậm chí ở
121
o
C trong 28 phút, các SE vẫn giữ đươc hoạt tính sinh học. Tính kháng nhiệt của SE
trong thực phẩm cao hơn so với trong môi trường nuôi cấy. Tụ cầu vàng sản sinh được
hơn 20 loại độc tố khác nhau từ SEA đến SEE, từ SEG đến SER và SEU. Trong các
nhóm độc tố (siêu kháng nguyên) do S. aureus sản sinh kể trên thì độc tố ruột nhóm B
(Staphylococcal enterotoxin B – SEB) là một độc tố mạnh, bền với nhiệt và hòa tan
trong nước, chúng có phổ phân bố rộng rãi và là nguyên nhân gây nhiễm trùng nhiễm
độc thực phẩm thường gặp nhất. Bên cạnh đó, SEB có khả năng kháng kháng sinh, ví
dụ tính kháng nhóm ß-lactam như methicillin. Nguy hiểm hơn, SEB còn là một trong
những nhóm độc tố được sử dụng làm vũ khí sinh học dùng để tấn công trong khủng
bố sinh học và chiến tranh sinh học. Vì thế việc xác định sự có mặt của SEB nhằm
đánh giá nguy cơ ngộ độc là vô cùng quan trọng.
Hiện nay, một số hãng trên thế giới đã sản xuất que thử phát hiện trực tiếp độc
tố SEB như: hãng Tetracore, hãng Advnt, hãng Alexeter Tuy nhiên, các que thử này
giá thành cao, không phù hợp với điều kiện kinh tế Việt Nam; kháng nguyên trong
nước có thể biến đổi không phù hợp với que thử nhập ngoại và nếu nhập que thử
nhanh, chúng ta sẽ không chủ động được nguồn khi cần thiết. Do đó, việc nghiên cứu
tạo ra kháng nguyên tái tổ hợp không những loại bỏ được độc tố mà còn giữ nguyên
được đặc tính miễn dịch như kháng nguyên dại để gây miễn dịch sản xuất kháng thể Luận văn thạc sỹ sinh học Nguyễn Thị Hoài Thu

K16 – Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 2

đơn dòng, đa dòng kháng SEB là cần thiết và đây là nguồn nguyên liệu quan trọng chế
tạo que thử phát hiện nhanh SEB phục vụ nhu cầu hiện nay ở trong nước.
Xuất phát từ lý do trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tạo
kháng nguyên tái tổ hợp Staphylococcal enterotoxin B (SEB) dạng không độc từ
đoạn gen seb tự nhiên để làm nguyên liệu phục vụ cho việc chế tạo que thử phát
hiện nhanh độc tố SEB”
Mục tiêu nghiên cứu
Tạo được kháng nguyên SEB mất độc tính hoặc có độc tính thấp và vẫn đảm
bảo tính kháng nguyên để ứng dụng cho việc tạo kháng thể đơn dòng gắn lên que thử
nhanh để phát hiện nhanh độc tố SEB của tụ cầu vàng.
Nội dung nghiên cứu
- Tách dòng và xác định trình tự của gen seb tự nhiên có kích thước khoảng 534
bp được phân lập từ chủng S. aureus ở Việt Nam
- Tạo gen seb đột biến điểm ở 04 vị trí bộ ba mã hóa lần lượt là 12, 32, 105 và
121 để thay thế amino acid Histidine thành Tyrosine.
- Thiết kế vector biểu hiện mang gen seb đột biến, biểu hiện và tối ưu các điều
kiện ảnh hưởng đến hiệu quả và chất lượng biểu hiện gen seb đột biến.
- Tinh sạch, định lượng protein tái tổ hợp SEB dạng đột biến và đánh giá tính
kháng nguyên của protein tái tổ hợp mtSEB bằng phương pháp Western blot.
- Kiểm tra độc tính của protein tái tổ hợp SEB trên động vật thử nghiệm.