Thạc Sĩ Nghiên cứu tạo đột biến khử độc và biểu hiện gen mã hoá kháng nguyên tái tổ hợp Staphylococcal enter

MỞ ĐẦU

Thực phẩm bị nhiễm vi khuẩn, độc tố của vi khuẩn hoặc thức ăn chứa các chất có tính độc hại đối với người ăn là một trong những nguyên nhân gây bệnh phổ biến trên toàn cầu, xảy ra ở các các nước có nền khoa học và y học phát triển cũng như các nước lạc hậu, kém phát triển. Tại Việt Nam, trong những năm gần đây số vụ nhiễm độc thực phẩm cũng ngày càng tăng và hậu quả ngày càng nghiêm trọng.
Tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) là vi khuẩn gây bệnh thường gặp nhất ở người và có khả năng gây nhiều bệnh khác nhau. Ngộ độc thức ăn do tụ cầu có thể do ăn, uống phải độc tố ruột của tụ cầu hoặc do tụ cầu vàng vốn cư trú ở đường ruột chiếm ưu thế về số lượng. Độc tố ruột staphylococcal enterotoxin B (SEB) bền với nhiệt là tác nhân chính thường gặp nhất trong các vụ ngộ độc thực phẩm do S. aureus. Hiện nay, việc phòng bệnh và điều trị bệnh ngộ độc do tụ cầu gặp rất nhiều khó khăn vì không phát hiện kịp thời tác nhân gây bệnh. Vì vậy, việc xác định sự có mặt SEB trong mẫu bệnh phẩm và thực phẩm đóng vai trò hết sức quan trọng.
Trên thế giới và tại Việt Nam hiện nay cũng đã phát triển các loại kít phát hiện nhanh tác nhân gây bệnh dựa trên nguyên tắc liên kết miễn dịch, phương pháp này đòi hỏi cần có kháng thể đặc hiệu. Do vậy việc biểu hiện và tinh sạch kháng nguyên SEB tái tổ hợp không có độc tính, có khả năng gây phản ứng miễn dịch tạo các kháng thể IgG đặc hiệu là cấp thiết.
Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tạo đột biến khử độc và biểu hiện gen mã hoá kháng nguyên tái tổ hợp Staphylococcal enterotoxin B (SEB) phục vụ cho việc chế tạo kít phát hiện tụ cầu vàng trong thực phẩm. ”




Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu chung

Nghiên cứu hệ thống biểu hiện và tinh sạch kháng nguyên tái tổ hợp staphylococcal enterotoxin B (SEB) đã được gây đột biến loại độc tính phục vụ cho việc chế tạo kít phát hiện vi khuẩn tụ cầu vàng (S. aureus) trong thực phẩm.
Mục tiêu cụ thể

- Thiết kế hệ vector biểu hiện gen mã hóa cho kháng nguyên tái tổ hợp SEB đã được gây đột biến loại độc tính.
- Biểu hiện và tinh sạch protein SEB trong tế bào vi khuẩn E. coli tạo nguyên liệu tạo kít phát hiện vi khuẩn tụ cầu vàng trong thực phẩm.
Nội dung nghiên cứu

Để thực hiện được mục tiêu đặt ra, đề tài thực hiện những nội dung chính sau:

- Nghiên cứu tạo vector biểu hiện gen mã hóa cho kháng nguyên tái tổ hợp SEB đã được gây đột biến loại độc tính.
- Nghiên cứu các điều kiện để tối ưu khả năng biểu hiện protein SEB trong tế bào vi khuẩn E. coli.
- Tinh sạch protein SEB để sử dụng làm nguyên liệu tạo kít phát hiện vi khuẩn tụ

cầu vàng trong thực phẩm.







MỤC LỤC

Trang

CÁC CHỮ VIẾT TẮT .viii DANH MỤC BẢNG . ix DANH MỤC HÌNH xi MỞ ĐẦU 1
CHưƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 3


1.1. Tình hình bệnh ngộ độc thực phẩm do Saphylococcus aureus và độc tố ruột staphylococcal enterotoxin B trên thế giới và tại Việt Nam 3

1.1.1. Khái quát về bệnh ngộ độc thực phẩm . 3


1.1.2. Tình hình dịch bệnh ngộ độc thực phẩm do Saphylococcus aureus và độc tố ruột staphylococcal enterotoxin B trên thế giới và tại Việt Nam 4

1.2. Tụ cầu vàng Staphylococcus aureus . 6


1.2.1. Đặc điểm phân loại 6


1.2.2. Đặc điểm vi khuẩn học 6


1.2.2.1. Hình dạng và kích thước 6


1.2.2.2. Độc tố và khả năng gây bệnh 7


1.2.3. Hệ gen tụ cầu vàng Staphylococcus aureus . 10


1.3. Nội độc tố ruột staphylococcal enterotoxin B 10


1.3.1. Cấu trúc phân tử staphylococcal enterotoxin B . 10


1.3.2. Cơ chế gây độc của staphylococcal enterotoxin B 12


1.3.3. Staphylococcal enterotoxin B tái tổ hợp và tiềm năng ứng dụng 14


CHưƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 16


2.1. Vật liệu, trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu 16


2.1.1. Chủng vi khuẩn và plasmid . 16


2.1.2. Các bộ kít 16


2.1.3. Hóa chất, máy móc và thiết bị . 16


2.1.4. Môi trường và đệm 17


2.1.5. Cặp mồi sử dụng 17


2.1.6. Phần mềm . 17


2.2. Phương pháp nghiên cứu . 17


2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu . 17


2.2.2. Các phương pháp nghiên cứu . 18


2.2.2.1. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) . 18


2.2.2.2. Phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR) 20


2.2.2.3. Phương pháp xử lý enzym hạn chế 20


2.2.2.4. Phương pháp tinh sạch ADN từ gel agarose 22


2.2.2.5. Phản ứng ghép nối gen ngoại lai vào vector 23




2.2.2.6. Phương pháp biến nạp ADN plasmid vào tế bào vi khuẩn Escherichia coli DH5α . 24

2.2.2.7. Phương pháp tách ADN plasmid từ tế bào vi khuẩn Escherichia coli

DH5α 24


2.2.2.8. Biểu hiện protein staphylococcal enterotoxin B tái tổ hợp trong tế bào

vi khuẩn Escherichia coli chủng BL21(DE3) 26


2.2.2.9. Phương pháp điện di protein trên gel polyacrylamide 26


2.2.2.10. Phương pháp tinh sạch protein 27


CHưƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28


3.1. Kết quả nhân gen seb phục vụ cho thiết kế vector biểu hiện 29


3.1.1. Thiết kế mồi . 30


3.1.2. Kết quả PCR nhân gen seb 31


3.1.3. Xử lý enzym hạn chế tạo đầu cắt so le trên gen seb 32


3.2. Kết quả thiết kế vector biểu hiện pET21a+ mang gen seb đột biến . 34


3.2.1. Xử lý enzym hạn chế tạo đầu cắt so le trên pET21a+ 34


3.2.2. Phản ứng gắn đoạn gen đích seb vào vector biểu hiện . 36


3.2.3. Kết quả kiểm tra vector tái tổ hợp bằng phản ứng colony-PCR . 37


3.2.4. Kết quả kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng enzym hạn chế . 38


3.2.5. Kết quả giải trình tự gen seb đột biến trên vector biểu hiện . . 40

3.3. Kết quả biểu hiện gen mã hóa cho protein SEB tái tổ hợp . 39


3.3.1. Biến nạp vector tai tô hơp pET 21a+/SEB vào Escherichia coli chủng

BL21(DE3) . 40


3.3.2. Kiểm tra sự biểu hiện gen seb 41


3.3.3. Tối ưu các điều kiện biểu hiện gen seb 43


3.3.4. Tinh sạch protein tái tổ hợp SEB 47


KẾT LUẬN 49


KIẾN NGHỊ . 49


TÀI LIỆU THAM KHẢO . 50




CÁC CHỮ VIẾT TẮT


ADN Deoxyribonucleic acid APS Ammonium persulphate ARN Ribonucleic Acid
bp Base pair cs Cộng sự
dH2O Nước khử ion

dNTP Deoxyribonucleotide

EDTA Ethylene Diamine Tetraacetace Axit

IPTG Isopropylthio--D-galactoside

Kb Trạng Quỳnhbase

LB Luria and Bertani

PBS Phosphate buffer saline

PCR Polymerase Chain Reaction

S. aureus Staphylococcus aureus

SDS Sodium dodecyl sulfate

SEB Staphylococcal enterotoxin B SEs Staphylococcal enterotoxins v/p Vòng / phút