Thạc Sĩ Nghiên cứu tạo đột biến khử độc và biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên tái tổ hợp staphylococcal enter

NGHIÊN CỨU TẠO ĐỘT BIẾN KHỬ ĐỘC VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP STAPHYLOCOCCAL ENTEROTOXIN B (SEB) PHỤC VỤ CHO VIỆC CHẾ TẠO KÍT PHÁT HIỆN TỤ CẦU VÀNG TRONG THỰC PHẨM

MỤC LỤC

CÁC CHỮ VIẾT TẮT . viii
DANH MỤC BẢNG . ix
DANH MỤC HÌNH xi
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 3
1.1. Tình hình bệnh ngộ độc thực phẩm do Saphylococcus aureus và độc tố ruột
staphylococcal enterotoxin B trên thế giới và tại Việt Nam 3
1.1.1. Khái quát về bệnh ngộ độc thực phẩm . 3
1.1.2. Tình hình dịch bệnh ngộ độc thực phẩm do Saphylococcus aureus và độc
tố ruột staphylococcal enterotoxin B trên thế giới và tại Việt Nam 4
1.2. Tụ cầu vàng Staphylococcus aureus . 6
1.2.1. Đặc điểm phân loại 6
1.2.2. Đặc điểm vi khuẩn học 6
1.2.2.1. Hình dạng và kích thước 6
1.2.2.2. Độc tố và khả năng gây bệnh 7
1.2.3. Hệ gen tụ cầu vàng Staphylococcus aureus . 10
1.3. Nội độc tố ruột staphylococcal enterotoxin B 10
1.3.1. Cấu trúc phân tử staphylococcal enterotoxin B . 10
1.3.2. Cơ chế gây độc của staphylococcal enterotoxin B 12
1.3.3. Staphylococcal enterotoxin B tái tổ hợp và tiềm năng ứng dụng 14
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 16
2.1. Vật liệu, trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu 16
2.1.1. Chủng vi khuẩn và plasmid . 16
2.1.2. Các bộ kít 16
2.1.3. Hóa chất, máy móc và thiết bị . 16
2.1.4. Môi trường và đệm 17
2.1.5. Cặp mồi sử dụng 17
2.1.6. Phần mềm . 17
2.2. Phương pháp nghiên cứu . 17
2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu . 17
2.2.2. Các phương pháp nghiên cứu . 18
2.2.2.1. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) . 18
2.2.2.2. Phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR) 20
2.2.2.3. Phương pháp xử lý enzym hạn chế 20
2.2.2.4. Phương pháp tinh sạch ADN từ gel agarose 22
2.2.2.5. Phản ứng ghép nối gen ngoại lai vào vector 23
2.2.2.6. Phương pháp biến nạp ADN plasmid vào tế bào vi khuẩn Escherichia
coli DH5α . 24
2.2.2.7. Phương pháp tách ADN plasmid từ tế bào vi khuẩn Escherichia coli
DH5α 24
2.2.2.8. Biểu hiện protein staphylococcal enterotoxin B tái tổ hợp trong tế bào
vi khuẩn Escherichia coli chủng BL21(DE3) 26
2.2.2.9. Phương pháp điện di protein trên gel polyacrylamide 26
2.2.2.10. Phương pháp tinh sạch protein 27
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28
3.1. Kết quả nhân gen seb phục vụ cho thiết kế vector biểu hiện 29
3.1.1. Thiết kế mồi . 30
3.1.2. Kết quả PCR nhân gen seb 31
3.1.3. Xử lý enzym hạn chế tạo đầu cắt so le trên gen seb 32
3.2. Kết quả thiết kế vector biểu hiện pET21a+ mang gen seb đột biến . 34
3.2.1. Xử lý enzym hạn chế tạo đầu cắt so le trên pET21a+ 34
3.2.2. Phản ứng gắn đoạn gen đích seb vào vector biểu hiện . 36
3.2.3. Kết quả kiểm tra vector tái tổ hợp bằng phản ứng colony-PCR . 37
3.2.4. Kết quả kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng enzym hạn chế . 38
3.2.5. Kết quả giải trình tự gen seb đột biến trên vector biểu hiện . . 40
3.3. Kết quả biểu hiện gen mã hóa cho protein SEB tái tổ hợp . 39
3.3.1. Biến nạp vector tá i tổ hợ p pET21a+/SEB vào Escherichia coli chủng
BL21(DE3) . 40
3.3.2. Kiểm tra sự biểu hiện gen seb 41
3.3.3. Tối ưu các điều kiện biểu hiện gen seb 43
3.3.4. Tinh sạch protein tái tổ hợp SEB 47
KẾT LUẬN 49
KIẾN NGHỊ . 49
TÀI LIỆU THAM KHẢO . 50