Thạc Sĩ Nghiên cứu tạo đột biến in vitro và đánh giá sinh trưởng, phát triển, sai khác di truyền của các dòn

LUẬN ÁN TIẾN SĨ
NĂM 2014
MỤC LỤC


Danh mục các hình x
MỞ ĐẦU 1
1 Tính cấp thiết của đề tài 1
2 Mục tiêu nghiên cứu 2
3 Yêu cầu của đề tài 2
4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3
5 Đóng góp mới của luận án 4
Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5
1.1 Giới thiệu chung về cây hoa cẩm chướng 5
1.1.1 Nguồn gốc, phân loại 5
1.1.2 Đặc điểm thực vật học của cây hoa cẩm chướng 7
1.1.3 Yêu cầu ngoại cảnh của hoa cẩm chướng 7
1.1.4 Yêu cầu dinh dưỡng 8
1.2 Tình hình sản xuất hoa cẩm chướng trên thế giới và trong nước 9
1.2.1 Tình hình sản xuất hoa cẩm chướng trên thế giới 9
1.2.2 Tình hình sản xuất hoa cẩm chướng tại Việt Nam 11
1.3 Ứng dụng phương pháp nuôi cấy mô, tế bào trong nhân giống cây
hoa cẩm chướng 12
1.4 Đột biến tạo biến dị di truyền và ứng dụng đột biến trong chọn tạo
giống cây trồng 16
1.4.1 Đột biến tạo biến dị di truyền 16
1.4.2 Các tác nhân gây đột biến 17
1.4.3 Vai trò của đột biến nhân tạo trong công tác chọn tao giống cây trồng 21
1.5 Xử lý gây tạo đột biến trong nuôi cấy in vitro và ứng dụng trong
chọn tạo giống cây trồng 24
1.5.1 Xử lý gây tạo đột biến trong nuôi cấy in vitro 24
1.5.2 Các phương pháp xử lý gây tạo đột biến trong nuôi cấy in vitro 25
1.5.3 Nguồn vật liệu xử lý đột biến in vitro 29
1.5.4 Sàng lọc thể đột biến 29
1.6 Một số kết quả nghiên cứu về cây hoa cẩm chướng 30
1.6.1 Kết quả nghiên cứu trên thế giới 30
1.6.2 Kết quả nghiên cứu trong nước 35
Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39
2.1 Vật liệu nghiên cứu 39
2.2 Nội dung nghiên cứu 41
2.2.1 Nghiên cứu nhân giống in vitro cho cây cẩm chướng giống Quận Chúa 41
2.2.2 Nghiên cứu các phương pháp xử lý gây tạo đột biến in vitro cho cây
cẩm chướng 41
2.2.3 Nghiên cứu phân lập các dạng chồi in vitro biến dị sau xử lý và đánh
giá sự sinh trưởng phát triển của các dạng chồi 41
2.2.4 Nghiên cứu sự sinh trưởng phát triển và phân lập các dạng biến dị
của cây cẩm chướng sau xử lý trong điều kiện tự nhiên 42
2.2.5 Nghiên cứu đánh giá sự sai khác di truyền của một số dòng biến dị
có triển vọng đã phân lập bằng chỉ thị SSR 42
2.2.6 Nghiên cứu quy trình nhân giống in vitro cho một số dòng đột biến
được tuyển chọn 42
2.3 Phương pháp nghiên cứu 42
2.3.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm 42
2.3.2 Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật. 47
2.3.3 Phương pháp gây tạo đột biến in vitro 47
2.3.4 Phương pháp đánh giá sự sai khác di truyền của các dòng đột biến
bằng chỉ thị phân tử SSR 50

2.4 Phương pháp xử lý số liệu 55
2.5 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 54
Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 56
3.1 Nghiên cứu nhân giống in vitro cho cây cẩm chướng giống Quận Chúa 56
3.1.1 Nghiên cứu tạo vật liệu khởi đầu 55
3.1.2 Nghiên cứu nhân nhanh chồi in vitro 56
3.1.3 Nghiên cứu tạo cây hoàn chỉnh 62
3.1.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp ra cây đến tỷ lệ sống và
sinh trưởng của cây in vitro ngoài vườn ươm 63
3.2 Nghiên cứu xử lý gây tạo đột biến cho cây hoa cẩm chướng in vitro
bằng EMS và tia gamma nguồn
60
Co 65
3.2.1 Nghiên cứu xử lý gây tạo đột biến cho cây hoa cẩm chướng nuôi cấy
in vitro bằng EMS 65
3.2.2 Nghiên cứu xử lý gây tạo đột biến cho cây hoa cẩm chướng nuôi cấy
in vitro bằng tia gamma nguồn 60Co 75
3.2.3 Nghiên cứu xử lý kết hợp EMS và tia gamma nguồn 60Co cho cây
hoa cẩm chướng in vitro 80
3.3 Nghiên cứu khả năng sinh trưởng, phát triển của các dạng chồi in
vitro 84
3.3.1 Nghiên cứu khả năng ra rễ của các dạng chồi in vitro cây cẩm
chướng sau xử lý 85
3.3.2 Nghiên cứu sự sinh trưởng và phát triển của các dạng chồi in vitro
cây cẩm chướng sau xử lý trong điều kiện khí canh 86
3.3.3 Nghiên cứu sự sinh trưởng và phát triển của các dạng chồi in vitro
cây cẩm chướng sau xử lý giai đoạn ngoài đồng ruộng 88
3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của xử lý gây tạo đột biến đến sự phát sinh
biến dị của cây cẩm chướng giai đoạn ngoài đồng ruộng 89
3.4.1 Ảnh hưởng của xử lý EMS đến sự phát sinh biến dị của cây cẩm
chướng giai đoạn ngoài đồng ruộng 96

2.3.5 Phương pháp theo dõi, đánh giá 53

3.4.2 Ảnh hưởng của xử lý chiếu xạ đến tỷ lệ biến dị của cây cẩm chướng
sau xử lý giai đoạn ngoài đồng ruộng 96
3.4.3 Ảnh hưởng của xử lý kết hợp EMS và chiếu xạ đến tỷ lệ biến dị của
cây cẩm chướng sau xử lý giai đoạn ngoài đồng ruộng 96
3.4.4 Đặc điểm hình thái một số dạng biến dị về màu sắc hoa sau xử l ý
giai đoạn ngoài đồng ruộng 97
3.5 Nghiên cứu đánh giá sai khác di truyền của một số dòng cẩm chướng
bằng kỹ thuật SSR 103
3.5.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số 103
3.5.2 Kết quả phân tích sự nhân bản DNA với các cặp mồi 104
3.5.3 Kết quả phân tích chỉ số PIC với các cặp mồi 115
3.5.4 Đánh giá độ thuần di truyền của các dòng cẩm chướng nghiên cứu 117
3.5.5 Hệ số đồng dạng và mối quan hệ di truyền giữa các mẫu giống cẩm
chướng 117
3.6 Nghiên cứu nhân giống in vitro một số dòng đột biến được tuyển chọn 121
3.6.1 Nghiên cứu ảnh hưởng chế độ khử trùng đến tỷ lệ sống của mẫu 122
3.6.2 Đánh giá khả năng nhân nhanh in vitro của các dòng cẩm chướng đột
biến được tuyển chọn. 124
3.6.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của auxin đến khả năng tạo cây in vitro hoàn
chỉnh của hai dòng cẩm chướng H6 và H7 125
3.6.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp ra cây đến tỷ lệ sống và
sinh trưởng của cây in vitro ngoài vườn ươm 126
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 129
1 Kết luận 129
2 Đề nghị 130
Danh mục công trình đã công bố có liên quan đến luận án 131
Tài liệu tham khảo 132
Phụ lục 141



MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Trong nông nghiệp cùng với việc phát triển các cây lương thực, thực phẩm
cây hoa cũng đã trở thành một lĩnh vực thu hút được sự quan tâm và đầu tư bởi sản
xuất hoa đã trở thành một ngành thương mại mang lại lợi ích lớn cho nền kinh tế.
Trong những loài hoa cắt cành, cẩm chướng ngày càng được biết đến và ưa
chuộng bởi màu sắc đẹp, phong phú, kiểu dáng hoa đa dạng, hoa tươi lâu, dễ vận
chuyển, bảo quản Cẩm chướng đã trở thành một trong bốn loài hoa cắt cành
được trồng phổ biến trên thế giới, chiếm 17% tổng sản lượng hoa cắt (Nguyễn Thị
Kim Lý, 2012). Đây cũng là loại hoa có nhiều triển vọng trong sản xuất nội tiêu
cũng như xuất khẩu của Việt Nam. Ở nước ta hiện nay, chủ yếu trồng các giống
cẩm chướng nhập nội từ nước ngoài (Nguyễn Thị Kim Lý, 2012) do đó không chủ
động và chi phí sản xuất cao, đặc biệt là không thể mở rộng sản xuất và xuất khẩu
bởi không có bản quyền giống. Vì vậy, việc phát triển cây hoa có giá trị này không
chỉ là việc nhân nhanh các giống nhập nội hay tìm ra những biện pháp kỹ thuật
nhằm nâng cao năng suất chất lượng hoa mà còn phải tạo ra được những giống hoa
cẩm chướng mới đáp ứng được nhu cầu thị trường, phù hợp với điều kiện sinh thái
và có bản quyền của Việt Nam.
Đối với cây hoa việc chọn tạo giống tập trung chủ yếu là tạo giống có màu
sắc mới. Điều này được thực hiện thông qua con đường lai xa, đa bội hóa và gây
tạo đột biến (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2007). Tuy nhiên đối với cây hoa
cẩm chướng ở nước ta việc lai xa rất khó thực hiện bởi khả năng thụ phấn thụ tinh
rất khó. Vì vậy việc tạo giống có màu sắc mới chỉ có thể thực hiện thông qua con
đường gây tạo đột biến. Phương pháp chọn tạo giống bằng gây tạo đột biến được
nghiên cứu, phát triển từ giữa thế kỷ 20 và ngày càng phát triển rộng rãi mang lại
những thành tựu to lớn trong công tác chọn tạo giống cây trồng. Theo báo cáo của
Tổ chức Năng lượng nguyên tử quốc tế, tính đến năm 2013 đã có 3.200 giống cây
trồng đột biến thuộc trên 200 loài khác nhau được công nhận và ứng dụng trong
sản xuất (IAEA, 2013). Hơn thế nữa, việc gây tạo đột biến nhân tạo kết hợp với
nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro đã trở thành công cụ hữu hiệu giúp giảm thiểu
chi phí và thời gian chọn tạo giống cây trồng mới. Kỹ thuật xử lý đột biến in vitro
đã gây tạo và làm tăng tần số xuất hiện đột biến với các tính trạng có giá trị kinh tế
ở các loài thực vật nói chung và cây hoa nói riêng, góp phần không nhỏ cho việc
cải tiến giống cây trồng. (Okamura, 2006; Shu, 2009; IAEA, 2009, 2013). Bằng
phương pháp chọn lọc và lai tạo thông thường để tạo một giống cây trồng mới ổn
định về năng suất, có chất lượng cao phải mất 6 - 10 thế hệ, nhưng nếu áp dụng
phương pháp đột biến in vitro chỉ cần 3 - 6 thế hệ. Phương pháp này được đánh giá
là một trong những thành tựu của thế kỷ 20 (Đào Thị Thanh Bằng và cs., 1997).
Hiện nay trên thế giới việc nghiên cứu sử dụng các tác nhân như
Ethylmethane sulphonate (EMS) và tia gamma để gây đột biến in vitro cho nhiều
loại cây trồng được nhiều tác giả quan tâm và mang lại hiệu quả cao trong công
tác chọn tạo giống cây trồng mới (Arani and Majidi, 2004; Tulmann et al., 2004;
Luan và cs., 2007; Shin et al., 2007; Nguyễn Thị Lý Anh và cs., 2009a, 2009b,
2011b, ). Trong khi đó ở Việt Nam việc nghiên cứu xử lý đột biến in vitro trong
chọn tạo giống cây trồng nói chung và cây hoa nói riêng còn nhiều hạn chế. Xuất
phát từ những vấn đề nêu trên chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu tạo đột biến
in vitro và đánh giá sinh trưởng, phát triển, sai khác di truyền của các dòng đột
biến giống hoa cẩm chướng Quận Chúa (Dianthus caryophyllus L.)” phục vụ cho
công tác chọn tạo giống hoa cẩm chướng ở nước ta.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Nghiên cứu phương pháp xử lý đột biến in vitro nhằm xác định được
phương pháp xử lý đột biến hiệu quả và tạo được các dòng biến dị di truyền làm
nguồn nguyên liệu cho công tác chọn tạo giống hoa cẩm chướng mới.