Luận Văn Nghiên cứu tạo dòng, biểu hiện và thu nhận HIGF-1 (Human Insulin Like Growth Factor 1) tái tổ hợp từ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
Chuyên ngành: DI TRUYỀN
Mã số: 60 42 70
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Năm 2012
MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT . i
DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH . ii L
ỜI MỞ ĐẦU 1
PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
3 1.1 Nhân tố tăng trưởng hIGF-1
4 1.1.1. Giới thiệu
4 1.1.2. Đặc điểm gene mã hóa và cấu trúc phân tử protein hIGF-1 .
4 1.1.3. Đặc điểm hoạt động của hIGF-1 .
5 1.1.4. Chức năng của hIGF-1 trong cơ thể sống . 7
1.1.5. Các hướng ứng dụng hIGF-1 . 8
1.1.5.1. Điều trị bệnh IGFD . 8
1.1.5.2. Điều trị một số bệnh khác 9
1.1.5.3. Ứng dụng khác của hIGF-1
1.1.6. Tình hình nghiên cứu sản xuất hIGF-1 trên thế giới và ở Việt Nam
1.2. Công nghệ sản xuất protein tái tổ hợp trên Escherichia coli .
1.3. Tái gấp cuộn in vitro protein thu nhận từ thể vùi biểu hiện trong tế bào E. coli
1.4. Tinh chế thu nhận protein tái tổ hợp 1
1.5. Thử nghiệm hoạt tính sinh học hIGF-1 in vitro 18
PHẦN II: VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP .21
2.1. Vật liệu 22
2.1.1. Dụng cụ và thiết bị .22
2.1.2. Hóa chất và môi trường 23
2.1.3. Nguyên vật liệu 28
2.2. Phương pháp .30
2.2.1. Thu nhận gene higf-1 từ phIGF1 bằng phản ứng PCR .32
2.2.2. Tạo dòng gene higf-1 vào plasmid pET-22b 34
2.2.3. Tạo dòng tế bào E. coli DH5α mang vector tái tổ hợp pET22b-higf1 37
2.2.4. Tạo dòng tế bào E. coli Origami(DE3) mang vector pET22b-higf1 .40
2.2.5. Cảm ứng biểu hiện protein hIGF-1 ở E. coli Origami(DE3)/pET22b-higf1 .40
2.2.6. Tinh chế thu nhận hIGF-1 .44
2.2.7. Kiểm tra hoạt tính protein hIGF-1 thu nhận được 45
PHẦN III: KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN 43
3.1. Tạo dòng gene higf-1 vào plasmid pET-22b .48
3.1.1. Thu nhận gene higf-1 và chuẩn bị vector pET-22b 49
3.1.2. Tạo dòng E. coli DH5α mang vector tái tổ hợp pET22b-higf1 .50
3.2. Tạo dòng tế bào E. coli Origami(DE3)/pET22b-higf1 .55
3.3. Cảm ứng biểu hiện protein hIGF-1 .57
3.3.1. Phân tích sự biểu hiện protein hIGF-1 trong tế bào chất E. coli Origami(DE3)/pET22b-higf1 bằng Tricine SDS-PAGE 57 3.3.2. Khẳng định sự biểu hiện hIGF-1 bằng Western blot 58
3.4. Tinh chế thu nhận và kiểm tra hoạt tính protein hIGF-1 59
PHẦN IV: KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ 64
1. Kết luận 65
2. Đề nghị .65
TÀI LIỆU THAM KHẢO 66
PHỤ LỤC 70



DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1. Kết quả đo nồng độ plasmid pET-22b 50
Bảng 3.2. Lượng hIGF-1 trong các phân đoạn tinh chế .62
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc phân tử của hIGF-1 5
Hình 1.2. Các con đường truyền tín hiệu trong tế bào được kích hoạt bởi hIGF-1 6
Hình 1.3. Một số sản phẩm rhIGF-1 trên thị trường 12
Hình 1.4. Các phương pháp sắc ký được sử dụng để tinh chế protein 17
Hình 1.5. Nguyên tắc chung của phương pháp thử nghiệm sinh học in vitro 18
Hình 2.1. Cấu trúc plasmid pET-22b .28
Hình 2.2. Thang chuẩn protein và DNA .29
Hình 2.3. Chương trình PCR 33
Hình 3.1. Quy trình tạo dòng gene higf-1 vào plasmid pET-22b .48
Hình 3.2. Thu nhận gene higf-1 49
Hình 3.3. Kết quả biến nạp sản phẩm nối vào tế bào E. coli DH5α 51
Hình 3.4. Kết quả kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET22b-higf1 .52
Hình 3.5. Sơ đồ vị trí chèn gene higf-1 và vị trí bắt cặp của các mồi trên vector pET22b-higf1
Hình 3.6. Kết quả kiểm tra plasmid pET22b-higf1 bằng phản ứng PCR với cặp mồi T7 pro/T7 ter và cặp mồi 5’-NdeI-higf1 /T7 .54
Hình 3.7. Kết quả biến nạp plasmid tái tổ hợp pET22b-higf1 vào tế bào E. coli Origami(DE3) 56
Hình 3.8. Kết quả PCR khuẩn lạc E. coli Origami(DE3)/pET22b-higf1 với cặp mồi T7 pro/T7 ter
Hình 3.9. Kết quả kiểm tra sự biểu hiện protein hIGF-1 bằng điện di Tricine-SDS-PAGE
Hình 3.10. Chứng minh sự biểu hiện protein hIGF-1 bằng lai Western 59
Hình 3.11. Sắc ký đồ tinh chế thu nhận hIGF-1 bằng sắc ký trao đổi cation 60
Hình 3.12. Kết quả phân tích Tricine SDS-PAGE các phân đoạn protein thu nhận từ quá trình tinh chế sắc ký trao đổi cation .61
Hình 3.13. Kết quả phân tích độ tinh sạch của mẫu trước và sau tinh chế bằng phần mềm Quantity One (Biorad, Hoa Kỳ) .62
Hình 3.14. Ảnh hưởng của hIGF-1 sau tinh chế lên khả năng tăng sinh của dòng tế bào MCF-7


LỜI MỞ ĐẦU
hIGF-1 hay còn gọi là somatomedin C là một protein hormone được tạo ra chủ yếu ở gan nhờ sự kích thích của hormone tăng trưởng GH (Growth Hormone). hIGF-1 có vai trò kích thích sự tăng trưởng và phát triển của hầu hết các loại tế bào trong cơ thể đặc biệt là các tế bào cơ - xương, tế bào gan, tế bào thần kinh, tế bào da, tế bào tạo máu Bên cạnh đó hIGF-1 còn giúp cân bằng các chu trình chuyển hoá protein, lipid, carbohydrate cùng nhiều loại hormone và các hợp chất sinh học khác. Sự thiếu hụt hIGF-1 ở trẻ gây ra bệnh IGFD (Insulin-like growth factor 1 deficiency). Trẻ bị mắc bệnh IGFD bị lùn hơn so với trẻ bình thường và phát triển không cân đối trong khi lượng GH bình thường. Nguyên nhân có thể là do đột biến gene mã hóa cho hIGF-1 hoặc thụ thể của GH không đáp ứng được với GH Do đó để đảm bảo cho trẻ thiếu hụt hIGF-1 có khả năng phát triển bình thường thì việc phục hồi lượng hIGF-1 trong máu về mức bình thường là hết sức cần thiết. Hiện nay không có phương thuốc chữa trị hiệu quả cho những bệnh nhân mắc bệnh IGFD ở giai đoạn muộn, cách tốt nhất để chữa trị IGFD là phát hiện sớm bệnh nhân mắc bệnh và tiêm bổ sung đủ lượng hIGF-1 cần thiết bằng cách sử dụng rhIGF-1. Vào năm 2005 các sản phẩm hIGF-1 tái tổ hợp gồm Increlex (Tercia) và Iplex (Insmed) đã được FDA (Food & Drug Administration – Cơ quan Quản lý thuốc và thực phẩm, Hoa Kỳ) chấp nhận sử dụng là thuốc để điều trị trẻ bị lùn do thiếu hụt hIGF-1. Trong những năm qua các cơ quan có chức năng đã cho phép trẻ em có tầm vóc nhỏ, lùn được điều trị với rhIGF-1 ngày càng tăng lên. Một số nghiên cứu gần đây cho thấy hIGF-1 có tác dụng tích cực trong việc điều trị một số bệnh thần kinh, suy tim, tổn thương do bỏng, bệnh xơ cứng cột bên teo cơ, đái tháo đường loại 1, 2 và làm giảm lượng mỡ trong cơ thể. hIGF-1 còn được sử dụng trong công nghệ mỹ phẩm làm đẹp da và sử dụng cho các vận động viên thể dục thể thao để tăng lượng cơ bắp cũng như tăng cường các quá trình đồng hóa giúp tăng cường thể lực. Ngoài ra, đang có rất nhiều nghiên cứu đang được tiến hành để làm rõ hơn vai trò và khả năng ứng dụng của hIGF-1.

Tại Việt Nam các sản phẩm hIGF-1 chủ yếu được nhập về từ nước ngoài với giá thành cao. Việc nghiên cứu tìm ra một quy trình sản xuất protein với hiệu suất cao, đơn giản và rẻ tiền nhằm sản xuất sản lượng lớn hIGF-1 giá rẻ phục vụ cho việc điều trị bệnh cũng như phục vụ các nghiên cứu ứng dụng trong nước là hết sức cần thiết. Do đó, Bộ môn Công nghệ Sinh học Phân tử và Môi trường, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh đã tiến hành nghiên cứu sản xuất protein hIGF-1 bằng công nghệ DNA tái tổ hợp. Trong khuôn khổ chương trình nghiên cứu, luận văn này được thực hiện nhằm: “Nghiên cứu tạo dòng, biểu hiện và thu nhận hIGF-1 (human insulin-like growth factor 1) từ Escherichia coli”. Luận văn bao gồm các nội dung chính như sau:
1. Tạo dòng gene higf-1 vào plasmid pET-22b.
2. Tạo chủng E. coli DH5α mang plasmid tái tổ hợp pET22b-higf1.
3. Tạo chủng tế bào E. coli Origami(DE3) mang vector