Thạc Sĩ Nghiên cứu tạo dòng biến dị in vitro ở cây lan Hài Hồng (Paphiopedilum delenatii) và Vân Hài (Paphio

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
NĂM- 2011

MỤC LỤC

Danh mục từ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình
Mở đầu . . .1
Mục tiêu của đề tài 3
Điểm mới của luận văn .3
Tóm tắt kết quả đạt được 3

Chương I: Tổng quan tài liệu
1.1 Tổng quan về cây lan Hài .4
1.1.1 Phân loại .4
1.1.2 Hình thái .5
1.1.3 Sinh thái .8
1.1.4 Hiện trạng cây lan Hài Việt Nam .9
1.1.5 Sơ lược về lan Hài Hồng và Vân Hài .12
1.1.5.1 Hài Hồng (Paphiopedilum delenatii) . .12
1.1.5.2 Vân Hài (Paphiopedilum callosum) 13
1.2 Kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật 15
1.2.1 Môi trường nuôi cấy mô thực vật 16
1.2.1.1 Các loại muối khoáng .16

1.2.1.2 Vitamin .17
1.2.1.3 Chất điều hòa sinh trưởng .17
1.2.1.4 Các chất bổ sung .18
1.2.2 Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô trong nghiên cứu và sản xuất .19
1.3 Tạo giống cây trồng mới bằng phương pháp chiếu xạ 20
1.3.1 Đột biến và phân loại đột biến .20
1.3.2 Các tác nhân gây đột biến 21
1.3.2.1 Tác nhân vật lý 22
1.3.2.2 Tác nhân hóa học 23
1.3.3 Tác dụng của bức xạ ion hóa lên cơ thể sống 24
1.3.4 Gây đột biến bằng bức xạ ion hóa và ứng dụng trong tạo giống cây trồng . 25
1.4 Chọn lọc dòng biến dị .29
1.4.1 Chọn lọc dựa trên karyotype của thực vật .30
1.4.2 Kỹ thuật PCR .31
1.4.2.1 Nguyên tắc kỹ thuật PCR 31
1.4.2.2 Quy trình kỹ thuật PCR .32
1.4.2.3 Ứng dụng của kỹ thuật PCR .32
1.4.2.4 Các hạn chế của kỹ thuật PCR 34
1.4.2.5 Kỹ thuật phân tích tính đa hình của DNA được nhân bản ngẫu nhiên (RAPD) . .34

Chương II: Vật liệu và phương pháp

2.1 Vật liệu 37

2.2 Các phương pháp nghiên cứu 38
2.2.1 Nghiên cứu điều kiện khử trùng mẫu .38
2.2.2 Nghiên cứu quy trình nuôi cấy in vitro lan Hài .39
2.2.2.1 Khảo sát môi trường hình thành callus của lan Hài 39
2.2.2.2 Khảo sát môi trường nhân nhanh PLB 41
2.2.2.3 Khảo sát môi trường nhân nhanh chồi 43
2.2.2.4 Khảo sát môi trường tái sinh cây lan Hài in vitro .45
2.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của bức xạ ion hóa lên mẫu lan Hài in vitro .46
2.2.3.1 Chiếu xạ mẫu 47
2.2.3.2 Khảo sát ảnh hưởng mẫu sau chiếu xạ 47
2.2.3.3 Tạo và xác định các dòng biến dị. 48
2.2.4 Chọn lọc sau chiếu xạ 48
2.2.4.1 Chọn lọc cây có biểu hiện khác biệt về kiểu hình trong nuôi cấy in vitro . 48
2.2.4.2 Kiểm tra sự biến đổi di truyền 49
2.2.5 Xử lý thống kê số liệu 51

Chương III: Kết quả và thảo luận

3.1 Khảo sát điều kiện khử trùng và nuôi cấy mô lan Hài 52
3.1.1 Điều kiện khử trùng mẫu .52
3.1.2 Khảo sát môi trường tạo callus 53
3.1.3 Khảo sát môi trường nhân nhanh PLB .56
3.1.4 Khảo sát môi trường nhân nhanh chồi .58

3.2 Chiếu xạ tạo các dòng biến dị lan Hài trong điều kiện in vitro .61
3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng chiếu xạ tia gamma và chùm ion lên mẫu lan Hài in vitro .61
3.2.1.1 Khảo sát tác động bức xạ gamma đối với mẫu lan Hài 62
3.2.1.1 Khảo sát tác động bức xạ chùm ion lên mẫu lan Hài in vitro .65
3.2.2 Tạo dòng biến dị 66
3.3 Chọn lọc các dòng biến dị in vitro 69
3.3.1 Chọn lọc kiểu hình .69
3.3.2 Chọn lọc dựa trên chất liệu di truyền .72
3.3.2.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số .75
3.3.2.2 Kết quả phân tích bằng kỹ thuật RAPD 77

Chương IV: Kết luận và đề nghị

4.1 Kết luận .83
4.2 Đề nghị 84
Tài liệu tham khảo .86
Phụ lục


DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 Các nhóm lan Hài Việt Nam theo thứ hạng bảo tồn của Tổ chức
Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế (IUCN) . .10
Bảng 2.1 Nghiệm thức ảnh hưởng của các chất ĐHST đến khả năng tạo callus 40
Bảng 2.2 Nghiệm thức ảnh hưởng của các chất ĐHST lên hệ số nhân PLB 42
Bảng 2.3 Nghiệm thức ảnh hưởng của các chất ĐHST lên hệ số nhân chồi . . 44
Bảng 2.4 Khảo sát môi trường tái sinh cây lan Hài in vitro . 45
Bảng 2.5 Tên và trình tự các đoạn mồi . 50
Bảng 3.1 Tình trạng mẫu đỉnh sinh trưởng lan Hài sau khử trùng 6 tuần .52
Bảng 3.2 Tình trạng hạt lan Hài sau khử trùng và gieo hạt 10 tuần . .53
Bảng 3.3 Khả năng tạo callus từ PLB .55
Bảng 3.4 Ảnh hưởng của các chất ĐHST lên hệ số nhân PLB . 57
Bảng 3.5 Ảnh hưởng của các chất ĐHST lên hệ số nhân chồi của lan Hài 58
Bảng 3.6 Khả năng tái sinh hoàn chỉnh của cây lan Hài .60
Bảng 3.7 Giá trị LD50 của các mẫu lan Hài Hồng và Vân Hài .65
Bảng 3.8 Khả năng biến dị của cây lan Hài sau khi chiếu xạ tia gamma. 67
Bảng 3.9 Các dạng biến dị in vitro của cây lan Hài sau khi chiếu xạ chùm ion .68
Bảng 3.10 Đặc điểm của các dòng biến dị từ lan Hài Hồng chiếu xạ chùm ion(mẫu phân tích DNA) 73
Bảng 3.11 Đặc điểm của các dòng biến dị từ lan Vân Hài chiếu xạ chùm ion (mẫu
Bảng 3.12 Kết quả tách chiết DNA của các dòng lan Hài biến dị và mẫu đối chứng dùng trong kỹ thuật RAPD . 76
Bảng 3.13 Tổng số phân đoạn DNA xuất hiện khi điện di sản phẩm RAPD lan Hài Hồng .78
Bảng 3.14 Hệ số tương đồng di truyền của các dòng Hài Hồng .78
Bảng 3.15 Tổng số phân đoạn DNA xuất hiện khi điện di sản phẩm RAPD lan Vân Hài 80
Bảng 3.16 Hệ số tương đồng di truyền của các dòng Vân Hài . .81
Bảng 3.17 Tỉ lệ sống của mẫu PLB và chồi lan Hài sau chiếu xạ 2 tháng và 4 tháng .phụ lục
Bảng 3.18 Tỉ lệ sống của mẫu cây lan Hài sau chiếu xạ 4 tháng phụ lục



DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Một số loài lan Hài của Việt Nam 7
Hình 1.2 Lan Hài Hồng . 12
Hình 1.3 Lan Vân Hài .14
Hình 1.4 Sơ đồ kỹ thuật RAPD .35
Hình 2. Quy trình thực hiện thí nghiệm 46
Hình 3.1 Mẫu lan Hài in vitro ở các giai đoạn khác nhau 59
Hình 3.2 Mẫu PLB và chồi lan Hài chết sau chiếu xạ 62
Hình 3.3 Ảnh hưởng của bức xạ gamma Co-60 lên sự sống sót của mẫu lan Hài Hồng in vitro .63
Hình 3.4 Ảnh hưởng của bức xạ gamma Co-60 lên sự sống sót của mẫu lan Vân Hài in vitro .64
Hình 3.5 Các dạng biến dị ở cây Hài Hồng bởi chùm ion 70
Hình 3.6 Các dạng biến dị ở cây Vân Hài bởi chùm ion 71
Hình 3.7 Các dòng biến dị lan Hài Hồng thế hệ M1V2 (mẫu phân tích DNA) 72
Hình 3.8 Các dòng biến dị lan Vân Hài thế hệ M1V2 (mẫu phân tích DNA) 72
Hình 3.9 Kết quả điện di mẫu DNA lan Hài .75
Hình 3.10 So sánh ba dòng lan Hài Hồng ở mức độ phân tử 79
Hình 3.11 Kết quả điện di sản phẩm RAPD với các primer OPD5 và OPD6 của 6 dòng lan Vân Hài . .79
Hình 3.12 So sánh năm dòng lan Vân Hài ở mức độ phân tử . 81
Hình 3.13 Kết quả điện di sản phẩm RAPD của Hài Hồng phụ lục
Hình 3.14 Kết quả điện di sản phẩm RAPD của Vân Hài phụ lục



MỞ ĐẦU

Đã từ lâu, hoa lan được cả thế giới ca ngợi là “Nữ hoàng của các loài hoa”. Hoa lan đã chinh phục con người bởi cấu trúc kỳ diệu của đóa hoa cũng như bởi sự đa dạng về màu sắc, hình dạng và hương thơm quyến rũ của nó. Nhu cầu trồng và thưởng thức hoa lan của con người ngày càng tăng bởi vẻ đẹp và độ bền của hoa.

Lan Hài Vệ nữ (Paphiopedilum sp.) với hình dạng độc đáo như chiếc hài của phụ nữ và vẻ đẹp quý phái được coi là nhóm đặc sắc nhất trong họ lan. Đây là một trong những loài thực vật kiểng được ưu thích và có giá trị thương mại cao nhất trên thế giới. Không chỉ quý vì vẻ đẹp, lan Hài còn là một trong những loài thực vật hiếm nhất trên thế giới hiện nay.

Là một nước nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, Việt Nam được các nhà khoa học xác định là một trong những cái nôi của loài lan Hài Vệ nữ với khoảng 20 loài, trong đó có nhiều loài có tính đặc hữu hẹp. Tuy nhiên, do sự khai thác ồ ạt thiếu kiểm soát và nạn phá rừng tràn lan, các loài lan Hài quý hiếm của Việt Nam đang có nguy cơ tuyệt chủng ngoài tự nhiên. Để bảo vệ nguồn gen quý này, Công ước quốc tế về buôn bán các loài động, thực vật hoang dã có nguy cơ tuyệt chủng (CITES) đã cấm xuất khẩu các loài lan Hài của Việt Nam dưới mọi hình thức.

Là loài lan Hài có tính đặc hữu rất hẹp, lan Hài Hồng (Paphiopedilum delenatii) là một trong các loài lan quý hiếm nhất của Việt Nam cũng như của thế giới. Được người Pháp phát hiện từ đầu thế kỷ 20, lan Hài Hồng đã nhanh chóng được ưa thích trên toàn thế giới bởi vẻ đẹp quý phái nhưng thanh nhã của nó. Do có giá trị thương mại cao và tính đặc hữu rất hẹp, độ mẫn cảm với môi trường cao mà lan Hài Hồng ngoài tự nhiên đang trong tình trạng có nguy cơ tuyệt chủng trầm trọng.

Khác với lan Hài Hồng, Vân Hài (Paphiopedilum callosum) là một trong các loài lan Hài có khu vực phân bố rộng. Tuy vậy, do giá trị thương mại cao lại dễ khai thác do khu vực sống của loài lan này ở độ cao thấp, gần suối nên hiện nay Vân Hài ngoài tự nhiên cũng đang có nguy cơ tuyệt chủng.

Với mong muốn góp phần bảo tồn đồng thời tạo nguồn biến dị in vitro làm nguyên liệu cho công tác tạo giống hai loài lan Hài quý hiếm này, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu tạo dòng biến dị in vitro ở cây lan Hài Hồng (Paphiopedilum delenatii) và Vân Hài (Paphiopedilum callosum) bằng phương pháp chiếu xạ”.