Thạc Sĩ Nghiên cứu tạo dòng biến dị hình thái trên cây địa lan Tím hột in vitro bằng phương pháp chiếu xạ ga

MỞ ĐẦU

Chọn giống thực vật bằng cách gây đột biến nhân tạo là một phương pháp đã được chứng minh là có hiệu quả cao, góp phần tạo nên những tính trạng quý của cây trồng. Kỹ thuật này hiện nay là một trong những phương pháp tạo và chọn giống có nhiều ưu điểm và đã được sử dụng rộng rãi trên khoảng 60 quốc gia từ khắp các Châu lục. Theo nguồn dữ liệu thống kê các giống đột biến của IAEA (mutation variaties database) đến năm 2011 toàn thế giới đã tạo ra 3112 giống đột biến trên nhiều đối tượng cây trồng từ 170 loài thực vật mà chủ yếu là các loại Ngũ cốc [16], [23], [40], [42], Khoai [48], Mè [11], Cam [24] v.v. trong đó các giống tạo ra bởi phóng xạ gamma chiếm khoảng 60% [36], [53].
Bên cạnh đó, phương pháp tạo giống bằng tác nhân phóng xạ cũng đã tạo ra nhiều giống hoa đa dạng từ các giống mẹ ban đầu bao gồm: Cúc [39], [53], Cát tường [4], Anh thảo [50], Hồng môn [46], Phong lan [21], v.v. với nhiều màu sắc đa dạng. Riêng giống Địa lan hiện nay chỉ có 2 giống đột biến được công bố trong đó có một giống do các nhà tạo giống Nhật Bản và Hàn Quốc tạo ra bằng phương pháp chiếu xạ kết hợp nuôi cấy in vitro [53].
Mặc dù bắt đầu chậm hơn so với một số nước trên thế giới, tuy nhiên Việt Nam là nước đứng thứ 8 trên thế giới và thứ 3 trong khu vực Châu Á Thái Bình Dương về số lượng giống đột biến năm 2011 với 55 giống được công bố chính thức và được IAEA công nhận [53]. Chính vì vậy, hiện nay hướng nghiên cứu này đang được Bộ Khoa học Công nghệ tăng cường đầu tư với quy mô lớn và hiện đại. Nhằm mục tiêu tăng cường nghiên cứu giống đột biến nói riêng và ứng dụng Công nghệ Bức xạ trong Nông nghiệp nói chung Thủ tướng Chính phủ đã ký quyết định “Quy hoạch chi tiết phát triển ứng dụng bức xạ trong nông nghiệp đến năm 2020” trong đó có mục tiêu sẽ tạo ra và đưa vào sản xuất 3-4 giống đột biến cây trồng mới hàng năm.
Mặc khác, Cymbidium đã từ lâu được tôn vinh là “Nữ hoàng của các loài hoa”. Đây không những là loài hoa đẹp mà còn có giá trị về khoa học và mỹ thuật. Hiện nay, Địa lan đang rất được ưu chuộng trong nước cũng như trên Thế giới. Ở nước ta, loài cây này chủ yếu được trồng ở Đà Lạt và được xuất khẩu với số lượng lớn sang thị trường các nước khác như Mỹ, Nhật, Singapore, v.v. và đã mang lại nguồn thu nhập tương đối lớn cho người trồng hoa.
Mặc dù vậy, hiện nay tình hình xuất khẩu loại hoa này đang gặp khó khăn vì rào cản về bản quyền giống cây trồng mà nguyên nhân chính là hầu hết các giống Địa lan thương phẩm đang được trồng trong nước chủ yếu là các giống nhập nội. Chính vì vậy, việc tạo ra các giống hoa Địa lan mang thương hiệu “Việt” là yêu cầu cấp bách đối với các nhà chọn giống trong giai đoạn hiện nay. Từ yêu cầu đặt ra là cần phải tạo ra những giống Địa Lan để cung cấp cho thị
trường trong nước cũng như đáp ứng mục tiêu xuất khẩu. Đề tài “Nghiên cứu tạo dòng biến dị hình thái trên cây địa lan Tím hột (Cymbidium La Bell “Anna Belle”) in vitro bằng phương pháp chiếu xạ gamma [SUP]60[/SUP]Co” được tiến hành. Mục đích của nghiên cứu này là là gây tạo và chọn lọc các dòng Địa Lan Tím hột biến dị hình thái in vitro để làm nguyên liệu cho quá trình chọn tạo các giống Địa lan đột biến mới có tính ưu việt mang thương hiệu “Việt” bằng phương pháp chiếu xạ gamma [SUP]60[/SUP]Co.

MỤC LỤC

Trang phụ bìa
Mục lục i
Danh mục các chữ viết tắt v
Danh mục các bảng . vi
Danh mục các hình vẽ, đồ thị . viii
Mở đầu 1
Chương 1. TỔNG QUAN . 3
1.1. Phương pháp tạo giống cây trồng mới bằng phóng xạ 3
1.1.1. Các khái niệm chung 3
1.2.2. Lịch sử chọn giống đột biến . 4
1.1.3. Đột biến và các tác nhân gây đột biến 5
1.1.3.1. Vai trò của chọn giống bằng phương pháp vật lý . 5
1.1.3.2. Các tác nhân gây đột biến và hiệu quả tạo đột biến 6
1.1.3.3. Cơ chế gây đột biến do phóng xạ 8
1.1.3.4. Hiệu ứng sinh học của bức xạ lên cơ thể sống 9
1.1.4. Thành tựu của công nghệ bức xạ trong việc chọn tạo giống mới 11
1.1.4.1. Tình hình nghiên cứu đột biến trên thế giới 11
1.1.4.2. Tình hình nghiên cứu đột biến tại Việt Nam . 15
1.1.5. Chọn giống bằng phương pháp chiếu xạ kết hợp nuôi cấy in vitro 17
1.2. Tổng quan về cây địa lan (Cymbidium) 19
1.2.1. Nguồn gốc và sự phân bố . 19
1.2.2. Đặc điểm phân loại học. . 20
1.2.3. Đặc điểm hình thái của Địa lan 20
1.2.4. Tình hình nghiên cứu cây Địa lan 22
1.2.5. Giá trị của Địa lan và tình hình sản xuất tại Việt Nam 25
1.3. Sơ lược về nuôi cấy mô tế bào thực vật . 26
1.3.1. Lịch sử và những thành tựu đạt được trong nuôi cấy mô thực vật . 26
1.3.2. Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật 27
1.3.3. Tầm quan trọng của nuôi cấy mô tế bào thực vật . 29
1.3.3.1. Ý nghĩa sinh học cơ bản 29
1.3.3.2. Ý nghĩa thực tiễn . 30
1.4. Ứng dụng chỉ thị phân tử chọn lọc dòng biến dị 30
1.4.1. Vai trò của chỉ thị phân tử trong chọn giống cây trồng 30
1.4.2. Ứng dụng chỉ thị RAPD trong chọn giống . 31
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 35
2.1. Vật liệu 35
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu . 35
2.1.2. Dụng cụ và thiết bị 35
2.1.3. Hóa chất 37
2.1.4. Các điều kiện thí nghiệm 37
2.2. Phương pháp nghiên cứu 38
2.2.1. Nội dung 1. Hoàn thiện quy trình nuôi cấy in vitro cây Địa lan Tím
hột 39
2.2.1.1. Thí nghiệm 1. Khảo sát điều kiện khử trùng tạo mẫu trong ống nghiệm . 39
2.2.1.2. Thí nghiệm 2. Khảo sát khả năng hình thành callus từ PLB 40
2.2.1.3. Thí nghiệm 3. Khảo sát khả năng nhân nhanh PLB 41
2.2.1.4. Thí nghiệm 4. Khảo sát khả năng nhân chồi của cây Địa lan . 42
2.2.1.5. Thí nghiệm 5. Khảo sát khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh từ chồi in vitro của cây Địa lan . 43
2.2.2. Nội dung 2. Khảo sát ảnh hưởng của bức xạ gamma lên cây Địa lan 43
2.2.2.1. Thí nghiệm 1. Ảnh hưởng của bức xạ gamma 60Co lên sự sinh
trưởng và phát triển của mẫu Địa lan 43
2.2.2.2. Thí nghiệm 2. Gây tạo, xác định và phân lập các biến dị . 45
2.2.3. Nội dung 3. Phân tích đa dạng di truyền của một số dòng biến dị bằng kỹ thuật RAPD 46
2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu 48
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 49
3.1. Hoàn thiện quy trình nuôi cấy in vitro cây Địa lan . 49
3.1.1. Điều kiện khử trùng tạo mẫu trong ống nghiệm . 49
3.1.2. Khảo sát khả năng hình thành callus từ PLB . 51
3.1.3. Khảo sát khả năng nhân nhanh PLB . 52
3.1.4. Khảo sát khả năng nhân chồi của cây Địa lan 56
3.1.5. Khảo sát khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh . 59
3.2. Ảnh hưởng của bức xạ gamma lên cây Địa lan in vitro 62
3.2.1. Ảnh hưởng của bức xạ gamma 60Co lên sự sinh trưởng và phát triển của mẫu Địa lan . 62
3.2.2. Gây tạo, xác định và phân lập các biến dị 65
3.3. Phân tích đa dạng di truyền của một số dòng biến dị bằng kỹ thuật RAPD 71
3.3.1. Kết quả tách chiết DNA 71
3.3.2. Kết quả phân tích RAPD-PCR . 73
3.3.3. Tương quan di truyền của các mẫu Địa lan dựa trên phân tích RAPD 75
CHƯƠNG 4 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ . 77
4.1. Kết luận . 77
4.2. Đề nghị 78
DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ . 79
TÀI LIỆU THAM KHẢO . 80
PHỤ LỤC