Thạc Sĩ Nghiên cứu tạo cây thuốc lá chuyển gen kháng sâu VIP3A

1. MỞ ðẦU 1


1.1 ðặt vấn ñề 1


1.2 Mục ñích và yêu cầu 2


2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3


2.1 Giới thiệu chung về cây thuốc lá 3


2.1.1 Lịch sử hình thành - phát triển thuốc lá 4


2.1.2 Các ñặc ñiểm thực vật học cây thuốc lá 5


2.1.3 Tình hình sâu bệnh hại 6


2.1.5 Giá trị của cây thuốc lá 7


2.1.6 Tình hình sản xuất thuốc lá nguyên liệu 7


2.2. Chuyển gen ở thực vật - cơ sở khoa học của dề tài 9


2.2.1 Khái niệm chuyển gen 9


2.2.2 Các phương pháp chuyển gen cho cây trồng 10


2.3 Giới thiệu chung về Bacillus thuringiensis (Bt) 19


2.3.1 Lịch sử phát hiện ñộc tố Bt 19


2.3.2 Các loại protein ñộc tố của Bt 20


2.4 Một số thành tựu chuyển gen vào cây thuốc lá trên thế giới 22


2.5 Tình hình nghiên cứu về cây thuốc lá chuyển gen trong nước 23


3. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25


3.1 Vật liệu, hoá chất, thiết bị 25


3.1.1 Vật liệu 25


Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp iii


3.1.2 Hoá chất, thiết bị 25


3.2 ðịa ñiểm và thời gian: 26


3.3 Phương pháp nghiên cứu 26


3.3.1 Phương pháp thiết kế vector chuyển gen 26


3.3.2 Phương pháp chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào A. tumefaciens


bằng xung ñiện 31


3.3.3 Phương pháp chuyển gen vào thuốc lá thông qua A. tumefaciens


(theo Topping, 1998 ) 31


3.3.4 Phân tích cây chuyển gen bằng kỹ thuật PCR 33


3.4 Các chỉ tiêu theo dõi: 36


4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37


4.1 Thiết kế vector pBI121 mang gen vip3A 37


4.1.1 Thiết kế mồi 38


4.1.2 PCR nhân ñoạn gen vip3A và tinh sạch sản phẩm PCR 39


4.1.3 Ghép nối ñoạn gen vip3A vào vector tách dòng 40


4.1.4 Biến nạp plasmit tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α 40


4.1.5 Chọn lọc plasmit tái tổ hợp 41


4.1.6 Tạo vector chuyển gen mang gen vip3A 42


4.2 Chuyển gen vip3A vào cây thuốc lá 45


4.2.1 Biến nạp vector mang gen vip3A vào tế bào A. tumerfaciens


bằng xung ñiện 45


4.2.2 Chuyển cấu trúc mang gen vip3A vào cây thuốc lá thông qua vi


khuẩn A. tumefaciens 46


4.3 Kiểm tra và theo dõi kết quả chuyển gen 53


5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57


5.1 Kết luận 57


5.2 Kiến nghị 57


TÀI LIỆU THAM KHẢO 58


PHỤ LỤC 64