Tiến Sĩ Nghiên cứu tái sinh in vitro và tạo cây ca cao (Theobroma cacao L.) chuyển gen

LUẬN ÁN TIẾN SĨ
NĂM 2015
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 4
1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY CA CAO 4
1.1.1 Nguồn gốc và vị trí phân loại ca cao 4
1.1.2 Đặc điểm hình thái của cây ca cao . 5
1.1.3 Ý nghĩa kinh tế của cây ca cao 8
1.1.4 Bệnh do nấm ở cây ca cao 9
1.1.5 Phát triển cây ca cao ở Việt Nam . 11
1.2 NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN VÀ CHỌN TẠO GIỐNG Ở CÂY CA CAO 12
1.2.1 Nghiên cứu di truyền và chọn tạo giống ca cao theo phương pháp truyền
thống 12
1.2.2 Chọn tạo giống ca cao sử dụng công nghệ sinh học 15
1.3 GEN MÃ HÓA CHITINASE . 26
1.3.1 Nguồn gốc và cấu trúc của chitinase tự nhiên . 26
1.3.2 Chitinase ở một số đối tượng sinh vật 27
1.3.3 Vai trò của gen mã hóa chitinase 29
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 32
2.1 VẬT LIỆU . 32
2.1.1 Mẫu thực vật 32
2.1.2 Các vector và chủng vi khuẩn 32
2.13. Hóa chất, thiết bị 33
2.2 PHƯƠNG PHÁP 34
2.2.1 Các phương pháp liên quan đến tái sinh in vitro cây ca cao 34
2.2.2 Các phương pháp liên quan đến phân lập gen mã hóa chitinase và thiết kế các
vector chuyển gen thực vật 38
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ . 48
3.1 TÁI SINH IN VITRO MỘT SỐ DÒNG CA CAO NGHIÊN CỨU 48
3.1.1 Thu thập mẫu . 48
3.1.2 Xác định khả năng tạo mô sẹo từ nhị lép và cánh hoa ở các dòng ca cao . 49
3.1.3 Xác định khả năng nhân sinh khối mô sẹo từ nhị lép và cánh hoa ở các dòng ca
cao 51
3.1.4 Cảm ứng tạo phôi soma sơ cấp 53
3.1.5 Cảm ứng tạo phôi soma thứ cấp . 55
3.1.6 Tạo cây ca cao in vitro hoàn chỉnh 57
3.1.7 Khả năng thích ứng cây ca cao in vitro ra vườn ươm 60
3.1.8 Quy trình tái sinh in vitro cây ca cao . 62
3.2. PHÂN LẬP GEN MÃ HÓA CHITINASE VÀ THIẾT KẾ VECTOR BIỂU
HIỆN THỰC VẬT . 63
3.2.1 Nhân và tạo dòng vùng gen TcChi1_W . 63
3.2.2 Thiết kế vector biểu hiện thực vật mang gen mã hóa chitinase sử dụng hệ
vector pCB301 . 70
3.2.3 Tạo các chủng vi khuẩn A. tumefaciens tái tổ hợp chứa vector biểu hiện thực
vật đã thiết kế . 73
3.2.4 Kiểm tra hoạt động của cấu trúc gen chuyển trên cây thuốc lá . 75
3.3 CHUYỂN GEN CHỈ THỊ GUS/GUSPLUS VÀO CÂY CA CAO . 77
3.3.1 Lựa chọn chủng vi khuẩn, vector thích hợp và thời gian lây nhiễm vi khuẩn
cho chuyển gen vào ca cao 78
3.3.2 Chuyển gen chỉ thị gus/gusplus vào dòng ca cao TD8 80
3.3.3 Phân tích và đánh giá mô, cây chuyển gen 81
3.4 CHUYỂN GEN MÃ HÓA CHITINASE VÀO CÂY CA CAO 84
3.4.1 Biến nạp gen mã hóa chitinase vào dòng ca cao TD8 . 84
3.4.2 Kiểm tra cây ca cao chuyển gen bằng các phương pháp sinh học phân tử 87
3.4.3 Quy trình chuyển gen thông qua A. tumefaciens vào dòng ca cao TD8 89
CHƯƠNG 4: THẢO LUẬN . 91
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ . 102
NHỮNG CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 104
TÀI LIỆU THAM KHẢO 105
SUMMARY .
PHỤ LỤC .
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết
Ca cao (Theobroma cacao L.) là một trong những cây kinh tế quan trọng,
đem lại lợi nhuận đáng kể cho một số quốc gia trên thế giới. Bột ca cao được
sử dụng rộng rãi trong công nghiệp sản xuất bánh kẹo, thực phẩm, mỹ phẩm và
dược phẩm tại nhiều nước. Có nguồn gốc từ vùng Amazon ( Nam Mỹ), cây ca
cao phát triển mạnh ở các vùng có khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, trong đó có Việt
Nam. Hiện nay, cây ca cao đang được quan tâm để phát triển rộng rãi ở nước ta
vì cây có thể trồng trên nhiều loại đất khác nhau như triền dốc, đất cát, phù sa,
đất nghèo dinh dưỡng. Ngoài ra, ca cao còn là cây chịu bóng mát tốt, nên có
thể trồng xen canh với cây ăn trái, cây lâm nghiệp, phủ xanh đất tốt, thích hợp
với kinh tế hộ gia đình và đặc biệt, thị trường tiêu thụ sản phẩm ca cao là rất
lớn.
Tuy nhiên, tương tự các loài cây trồng khác, phát triển sản xuất ca cao gặp
nhiều khó khăn do giống bị thoái hóa, sự cạnh tranh của các loại cây trồng
khác, kỹ thuật canh tác chưa hiệu quả, sâu và bệnh hại . Riêng bệnh nấm đã
gây sụt giảm khoảng 30% sản lượng ca cao hàng năm trên toàn thế giới. Theo



truyền thống, có rất nhiều loại thuốc trừ sâu hóa học đang được sử dụng để
phòng trừ bệnh hại với chi phí tốn kém, gây ô nhiễm môi trường và gây ảnh
hưởng trực tiếp đến sức khỏe người sản xuất và tiêu dùng, cũng như môi
trường. Để cải thiện tình hình, giúp cho cây ca cao phát triển bền vững, nhiều
chương trình nghiên cứu nhằm nâng cao khả năng chống chịu sâu bệnh và các
tác nhân gây hại khác đã và đang được thực hiện với sự tham gia của nhiều tổ
chức nghiên cứu và thương mại tr ên thế giới. Bên cạnh công tác chọn tạo giống
theo phương pháp truyền thống, phương pháp chọn tạo giống ứng dụng công
nghệ sinh học như tạo cây chuyển gen là một trong hướng nghiên cứu triển
vọng trong việc tạo các giống ca cao có năng suất cao và chất lượng tốt, có khả
năng kháng sâu bệnh, chống chịu với các điều kiện bất lợi của môi trường.
Tại Việt Nam, nhiều dòng ca cao được cấp phép sử dụng rộng rãi được
nhập nội và tuyển chọn từ Malaysia trong Chương trình do Hiệp hội Ca cao
Thế giới (The World Cocoa Foundation) hỗ trợ. Chính phủ và nhiều tổ chức
quốc tế rất quan tâm phát triển cây ca cao nhằm đưa Việt Nam vào bản đồ ca
cao thế giới, trở thành quốc gia giàu tiềm năng về cung cấp ca cao. Hiện nay
chưa có nghiên cứu về tái sinh và chuyển gen vào cây ca cao ở Việt Nam. Bên
cạnh những thuận lợi và thành công đã đạt được trong lĩnh vực công nghệ sinh
học, những khó khăn có thể gặp phải trong quá trình nghiên cứu chọn tạo giống
cây trồng, trong đó có cây ca cao bằng công nghệ sinh học ở nước ta là không
nhỏ.
Trên cơ cở lý luận và thực tiễn của hướng nghiên cứu này, chúng tôi thực hiện
đề tài “Nghiên cứu tái sinh in vitro và tạo cây ca cao (Theobroma cacao L.)
chuyển gen”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Đề tài đặt mục tiêu chung là xây dựng được quy trình tái sinh in vitro và tạo cây
ca cao chuyển gen. Mục tiêu cụ thể:
- Xây dựng được quy trình tái sinh in vitro ở 1 - 2 dòng ca cao đang được canh tác
ở Việt Nam;
- Xây dựng được quy trình chuyển gen và tạo được cây ca cao chuyển gen chỉ thị
gus/gusplus và gen kháng nấm.