Thạc Sĩ Nghiên cứu Tách dòng và đọc trình tự gen cry1Ab, cry1Ac mã hóa protein tinh thể diệt côn trùng bộ cá

MỤC LỤC
Trang
Lời cam đoan
Lời cảm ơn
Mục lục i Danh mục các ký hiệu, viết tắt iv Danh mục các bảng v
Danh mục các hình (hình vẽ, ảnh chụp, đồ thị) vi
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 3
1.1.1. Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng Bacillus thuringiensis (Bt) trên thế giới 3
1.1.2. Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng Bacillus thuringiensis tại Việt Nam . 4
1.1.2.1. Thời kỳ mở đầu nghiên cứu 4
1.1.2.2. Thời kỳ sản xuất và ứng dụng (1984-1994) . 5
1.2. Đại cương về vi khuẩn Bacillus thuringiensis . 6
1.2.1 Đặc điểm hình thái 6
1.2.2 Đặc điểm sinh hoá . 8
1.2.3. Tính chất nuôi cấy 8
1.2.4. Phương pháp phân loại Bacillus thuringiensis . 9
1.2.5. Đặc điểm loài phụ Bacillus thuringiensis var. kurstaki . 11
1.2.6. Hệ thống di truyền của vi khuẩn 12
1.2.6.1. Hệ gen của vi khuẩn Bt 12
1.2.6.2. Phân loại gen độc tố diệt côn trùng của Bacillus thuringiensis 13
1.2.6.3. Vị trí của các gen mã hoá protein tinh thể diệt côn trùng trong tế bào . 13
1.2.6.4. Đặc điểm riêng của một số nhóm gen và độc tố của chúng 14

ii
1.3. Các loại độc tố của Bt 17
1.4. Đặc điểm của protein tinh thể độc . 18
1.4.1. Cấu trúc của protein tinh thể Cry 18
1.4.2. Cơ chế tác động của protein tinh thể diệt côn trùng 20
1.4.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến việc hình thành protein tinh thể độc 22
1.5. Đại cương về côn trùng thử nghiệm 24
1.6. Tổng quan về tạo dòng gen . 26
1.6.1. Khái niệm về tách dòng gen . 26
1.6.2. Vectơ tách dòng 26
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP . 30
2.1. Vật liệu 30
2.2. Hóa chất và thiết bị . 30
2.2.1. Hóa chất: 30
2.2.2. Thiết bị . 30
2.2.3. Môi trường . 31
2.3. Phương pháp nghiên cứu . 33
2.3.1. Phương pháp xác định nồng độ bào tử . 33
2.3.2. Phương pháp thử hoạt tính sinh học . 33
2.3.3. Kỹ thuật định typ huyết thanh 34
2.3.4. Phương pháp tách DNA plasmind . 35
2.3.5. Phương pháp PCR để khuếch đại gen cry1Ab, cry1Ac 36
2.3.6. Phương pháp tách dòng gen cry1Ab, cry1Ac . 37
2.3.6.1 Gắn sản phẩm PCR vào vectơ tách dòng pGEM – T Easy 37
2.3.6.2 Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E.coli DH5α 38
2.3.6.3 Phương pháp tách DNA plasmid của vi khuẩn E.coli DH5α . 38
2.3.7. Xác định trình tự nucleotid của đoạn gen đã tách dòng 39
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40

3.1. Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis mang gen cry1Ab,
cry1Ac có hoạt tính diệt côn trùng bộ cánh vảy . 40
3.1.1. Đặc điểm hình thái của Bacillus thuringiensis 40
3.1.2. Hình dạng tinh thể của các chủng Bt 41
3.1.3. Phân loại Bt bằng phương pháp huyết thanh . 42
3.1.5. Thử hoạt tính sinh học của các chủng Bt. var. kustaki phân lập 45
3.1.5.1. Xác định nồng độ bào tử 45
3.1.5.2. Thử nghiệm hoạt tính diệt sâu tơ (Plutella xylostella) của các chủng
Bt. var. kustaki phân lập . 46
3.2. Tách dòng và đọc trình tự gen cry1Ab và cry1Ac 47
3.2.1. Tách dòng gen cry1Ab, cry1Ac . 47
3.2.1.1. Gắn sản phẩm PCR vào vectơ tách dòng pGEM-T Easy 47
3.2.1.2. Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào vi khuẩn E. coli DH5α 48
3.2.1.3. Kiểm tra sự có mặt của gen cry1Ab, cry1Ac trong các dòng plasmid
tái tổ hợp 50
3.2.2. Xác định trình tự đoạn gen cry1Ab và cry1Ac 52
3.2.2.1. Xác định trình tự đoạn gen cry1Ab . 52
3.2.2.2. Xác định trình tự đoạn gen cry1Ac 54
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 57
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN . 58
Trịnh Thu Hà, Nguyễn Đình Tuấn, Vũ Thị Nhung, Trương Phúc Hưng, Ngô Đình Bính. 2009. “Đánh giá hoạt tính diệt ấu trùng muỗi tồn lưu trong chế phẩm Bacillus thuringiensis subsp. Israllensis tại Việt Nam”. Báo cáo khoa học. Hội Nghị Công nghệ sinh học toàn quốc 2009.
TÀI LIỆU THAM KHẢO . 59