Luận Văn Nghiên cứu tách chiết và khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của hỗn hợp các chất chuyển hóa thứ cấp tron

Đồ án tốt nghiệp năm 2012
Đề tài: Nghiên cứu tách chiết và khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của hỗn hợp các chất chuyển hóa thứ cấp trong một số loài rong nâu phổ biến ở tỉnh Khánh Hòa


MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN i
MỤC LỤC ii
DANH MỤC BẢNG . v
DANH MỤC HÌNH . vi
MỞ ĐẦU . 1
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN . 2
1.1. CHẤT CHUYỂN HOÁ THỨ CẤP VÀ HOẠT TÍNH . 2
1.1.1. Khái niệm về chất chuyển hóa thứ cấp . 2
1.1.2. Hoạt tính sinh học của chất chuyển hóa thứ cấp . 2
1.1.3. Các chất chuyển hoá thứ cấp từ rong biển 2
1.1.3.1. Acetogenins 2
1.1.3.2. Terpenoids 3
1.1.3.3. Alkaloids 4
1.1.3.4. Phenolics 5
1.1.3.5. Một số chất chuyển hoá thứ cấp từ rong biển 6
1.2. SƠ LƯỢC VỀ VI KHUẨN VIBRIO SPP GÂY BỆNH TRÊN TÔM 10
1.2.1. Đặc điểm của vi khuẩn Vibrio spp . 10
1.2.2. Bệnh ở tôm do vi khuẩn Vibrio spp . 11
1.3. ỨNG DỤNG CHẤT CHUYỂN HÓA ĐỂ SÀNG LỌC HOẠT TÍNH KHÁNG
WSSV. . 12
1.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT CÁC CHẤT CHUYỂN HÓA THỨ
CẤP TỪ RONG BIỂN . 13
1.4.1. Acetogenins . 13
1.4.2. Terpenoids . 13
1.4.3. Alkaloids . 13
1.4.4. Phenolics . 14
iii
1.5. KẾT LUẬN RÚT RA TỪ TỔNG QUAN . 15
CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
. 16
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 16
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 17
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17
2.3.1. Nghiên cứu điều kiện tối ưu ở công đoạn chiết cồn của quy trình tách chiết
17
2.3.1.1. Qui trình dự kiến tách chiết hỗn hợp chất chuyển hóa thứ cấp bằng ethanol 17
2.3.1.2. Giải thích quy trình: 18
2.3.1.3. Bố trí thí nghiệm: 19
2.3.2. Xác định hàm lượng các chất chuyển hóa thứ cấp từ rong biển Khánh Hòa
bằng phương pháp chiết ethanol. . 22
2.3.3. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của chất chuyển hóa thứ cấp chiết ethanol
từ một số loài rong phổ biến ở tỉnhKhánh Hòa. 23
2.3.3.1. Nguyên tắc 23
2.3.3.2. Tiến hành 23
2.3.4. Tách phân đoạn hỗn hợp các chất chuyển hóa thứ cấp bằng các dung môi
phân cực khác nhau. 24
2.3.5. Xác định hàm lượng các chất chuyển hóa thứ cấp theo từng phân đoạn tách
trên các dung môi có độ phân cực khác nhau . 26
2.3.6. Xác định hoạt tính kháng khuẩn của một số phân đoạn các chất chuyển hóa
thứ cấp đã tách chiết được trên các dung môi phân cực khác nhau 27
2.3.7. Các máy móc thiết bị dung trong nghiên cứu khoa học 27
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN . 28
3.1. Kết quả nghiên cứu điều kiện tối ưu của quy trình chiết ethanol . 28
3.1.1. Kết quả xác định nồng độ ethanol trong công đoạn chiết ethanol . 28
3.1.2. Kết quả xác định nhiệt độ chiết ethanol . 29
3.1.3. Kết quả xác định thời gian chiết ethanol 30
iv
3.2. Kết quả xác định hàm lượng các chất chuyển hóa thứ cấp từ rong biển Khánh
Hòa bằng phương pháp chiết ethanol. . 32
3.3. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của chất chuyển hóa thứ cấp chiết
ethanol từ một số loài rong phổ biến ở tỉnh Khánh Hòa. . 34
3.4. Xác định hàm lượng các chất chuyển hóa thứ cấp theo từng phân đoạn tách trên
dung môi có độ phân cực khác nhau. 36
3.5. Xác định hoạt tính kháng khuẩn của một số phân đoạn các chất chuyển hóa thứ
cấp đã tách chiết được trên các dung môi phân cưc khác nhau 36
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN . 38
TÀI LIỆU THAM KHẢO 39
PHỤ LỤC 40


MỞ ĐẦU
Trong thảm thực vật đa dạng và vô tận của đại dương, rong nâu là một trong số
các loài thực vật biển có khả năng tự tái tạo đáng được lưu ý nhất. Rong nâu chứa
nhiều các hợp chất thiên nhiên có giá trị dinh dưỡng và dược dụng cao. Đó là các chất
dinh dưỡng đường (galactose, manose, xylose, .); 17 axít béo không no; các chất
khoáng; keo và các vitamin cần thiết cho cơ thể sống; các polyphenol có khả năng
chống oxy hóa mạnh mẽ bảo vệ cơ thể loại trừ các gốc tự do nguy hiểm; fucoidan
fucan có khả năng kích thích hệ miễn dịch, chống viêm nhiễm, ngăn ngừa ung thư,
đồng thời làm tăng chỉ số chức năng gan; iốt hữu cơ giúp tuyến giáp hoạt động tối ưu,
alginate là chất giải độc tự nhiên và laminaran là chất chống đông tụ máu và ung thư.
Nước ta có bờ biển dài hơn 3.200 km trảidài từ Bắc xuống Nam,bao dọc hết
phía Đông và phía Nam đất nước với diện tích mặt nước rộng hơn 1.000.000 km
2
,
được thiên nhiên ban tặng cho nguồn tài nguyên rong nâu rất đa dạng và phong phú
trong đó rong mơ (Sargassaceae) được phát hiện trên 60 loài với sản lượng khai thác
ước tính trên 10.000 tấn/năm.
Tận dụng triệt để nguồn nguyên liệu phong phú, ngày nay có rất nhiều công
trình nghiên cứu về rong biển và đã đưa vào thực tiễn ứng dụng trên người, động vật
và thủy hải sản. Tuy nhiên nghiên cứu về hoạt tính sinh học từ rong biển thì không
nhiều.
Vì vậy,đề tài ”Nghiên cứu tách chiết và khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của
hỗn hợp các chất chuyển hóa thứ cấp trong một số loài rong nâu phổ biến ở tỉnh
Khánh Hòa” là cần thiết, góp phần mở rộng nguồn nguyên liệu dược liệu, công nghệ
sinh học và nông nghiệp.


CHƯƠNG I. TỔNG QUAN
1.1. CHẤT CHUYỂN HOÁ THỨ CẤP VÀ HOẠT TÍNH
1.1.1. Khái niệm về chất chuyển hóa thứ cấp
Các chất chuyển hóa thứ cấp là các hợp chất không cần thiết cho sự tăng
trưởng và tái sinh của thực vật, tuy nhiên các chất này góp phần giúp chothực vật
ngăn cản các loại động vật ăn cỏ sử dụng chúng làm thức ăn, giúp thực vật chống đỡ
các loài vi khuẩn, và giúp cho thực vật nhậnra các mối đe dọa xung quanh [6].
Các chất chuyển hóa thứ cấp là chìa khóa cho sự tương tác giữa thực vật với
môi trường hữu sinh và vô sinh đang gây ảnh hưởng lên chúng. Theo suốt lịch sử phát
hiện và ứng dụng của các chất chuyển hóa thứ cấp phục vụ cho loài người, có thể
phân chúng thành 4 nhóm chính: alkaloids, phenylpropanoids, flavonoids và
terpenoids và đối với rong biển các chất chuyển hóa thứ cấp có trong rong biển có thể
liệt kê thành 4 nhóm cấu trúc: Terpenoids, Acetogenins, Alkaloids và Phenolics.[9]
1.1.2. Hoạt tính sinh học của chất chuyển hóa thứ cấp
Hoạt tính sinh học của chất chuyển hóa thứ cấp có thể liệt kê ra như sau:
 Antistaphylococcal [4]
 Sử dụng chúng như tín hiệu phân loài [7]
 Kháng khuẩn, chống ôxy hóa[10]
 Hoạt tính gây độc tế bào [5]
 Chống mùi hôi [2]
 Kháng virus đốm trắng của tôm [8], tăng cường miễn dịch cho tôm [13]
1.1.3. Các chất chuyển hoáthứ cấp từ rong biển [3]
1.1.3.1. Acetogenins
Hình 1.1. Cấu trúc của acetogenins
3
Acetogenins là những hợp chất tự nhiên rất phức tạp, luôn có mặt nhiều tâm
đối xứng. Cấu trúc thông thường của acetogenin có ankan mạch chính thẳng dài đến
35 hoặc 37 nguyên tử carbon với đầu cuối mạch là một -lactone. Gốc ưa nước
thường là 1 đến 2 vòng tetrahydrofuran, một vài nhóm hydroxyl ở các vị trí khác
nhau. Hầu hết các trường hợp, tâm đối xứng trong acetogenin chính là các tâm phân
cực. Acetogenin trong rong thường có mạch carbon 11 hoặc 15 nguyên tử.
1.1.3.2. Terpenoids
Terpenoids, đôi khi còn có tên gọi isoterpenoid là các hợp chất hữu cơ tự nhiên
giống như terpene, gồm các dẫn suất tạo thành từ isoprene, ví dụ như:
Hình 1.2. Cấu trúc của terpenoids
Trong tảo, rất nhiều terpenoids còn có chứa halogen gọi chung là halogenate
terpenoids.
Hình 1.3. Cấu trúc của halogenate terpenoids
4
1.1.3.3. Alkaloids
Alkaloids là hoạt chất có nguồn gốc từ sinh vật, thường là thực vật. Phân tử
alkaloids luôn luôn có chứa C, H, N, và rất hay gặp oxi, đặc biệt có vài alkaloids có
chứa lưu huỳnh. Có ít hoặc nhiều phản ứng kiềm, những alkaloids đầu tiên phát hiện
được gọi là các chất kiềm thực vật. Chúng được coi như là các bazơ nitơ hữu cơ và
cho các muối với axít. Các muối này dễ kết tinh. Về danh pháp, tên của chúng
(thường nhắc đến tên cây mà từ đó chúng được chiết xuất) mang đuôi in.
Hàm lượng alkaloids trong thực vật thay đổi trong giới hạn rất rộng. Ngày nay
người ta qui ước nói đến thực vật có alkaloids khi hàm lượng của chúng lớn hơn
100ppm. Nhiều alkaloids có trong thực vật 2 đến 3%. Đặc biệt trong vỏ cây canh ki
na có hơn 10%. Alkaloids hòa tan trong dịch tế bào, ít thấy ở trạng thái tự do, thông
thường ở dạng muối (malat, xitrat, tactrat ) hoặc kết hợp với tanin. Trong một loài
thực vật hiếm thấy chỉ có một alkaloid, mà hay gặp một nhóm bazơ ít nhiều giống
nhau về cấu trúc.
Trong alkaloids, thường gặp amin bậc 1 bậc 2 hay bậc 3. Thông thường nitơ
tham gia vào nhân dị vòng, nhưng đôi khi cũng có thể ở ngoài vòng.
Nhiều alkaloids có tác dụng trên hệ thần kinh trung ương như là chất gây trầm
uất hoặc làm chất kích thích. Một số lớn các chất tác dụng lên dây thần kinh tự chủ:
chất kích thích giao cảm, các chất liệt giao cảm, các chất kích thích phó giao cảm, các
chất liệt phó giao cảm, các chất phong bế hạch giao cảm.
Trong số các alkaloids có các chất gây tê tại chỗ, có chất trị co giật. Một ít
alkaloid có tác dụng trên tim chống rung tim cũng có chất gây trầm uất. Nhiều
alkaloids có khả năng diệt ký sinh trùng, trị amip hoặc giun và kháng virus ở liều cao.
Một số alkaloids từ rong biển như:


TÀI LIỆU THAM KHẢO
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
[1] Bùi Quang Tề ( 2003 ), Bệnh của tôm nuôi và biện pháp phòng trị, NXB
Nông nghiệp Hà Nội.
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
[2] Jean-Philippe Mare´chal, Journal of Experimental Marine Biology and
Ecology 313 (2004) pp. 47–62
[3] Kasi Pandima Devi et al., (2008), “Bioprotective properties of seaweeds: In
vitro evaluation of antioxidant activity and antimicrobial activity against food borne
bacteria in relation to polyphenolic content”, BMC Complementary and Alternative
Medicine.
[4] Maria Kladi, Phytochemistry Letters 1 (2008), pp. 31 –36
[5] Maria Kladi, Tetrahedron Letters 46 (2005), pp. 5723–5726
[6] Maschek J. A. and B. J. Baker, The chemistry of Algal Secondary
Metabolism. In: Algal Chemical Ecology, ed. C. D. Amsler, Springer-Verlag Berlin
(2008), pp. 1-24
[7] Nai-Yun Ji, Biochemical Systematics and Ecology 35 (2007), pp. 627-630
[8] P. Rameshthangam, Virus Research 126 (2007), pp. 38 –44
[9] Paul A. N., The ecology of chemical defence in a filamentous marine red
alga. Thesis of Doctor of Phylosophy, New South Wales Univ, (2006)
[10] Piyalai hemtanon, (2005), Anti viral and Antibacterial Substances from
Spirulina platensis to combat White Spot Syndrome Virus and Vibrio harveyi
Diseases in Asian Aquaculture V, 525-534.
[11] Somepalli Venkateswarlu, Tetrahedron 63 (2007), pp. 6909 –6914
[12] Wilaiwan Chotigeat, (2004), Effect of Fucoidan on Disease Resistance of
Black Tiger ShrimpAquaculture (233) 23–30.
[13] Xuxiong Huang, Fish & Shellfish Immunology 20 (2006), pp. 750 -757