Thạc Sĩ Nghiên cứu tách chiết và khảo sát hoạt tính kháng khuẩn – chống oxi hoá của cao dịch chiết từ củ hàn

Luận văn thạc sĩ năm 2012
Đề tái: Nghiên cứu tách chiết và khảo sát hoạt tính kháng khuẩn – chống oxi hoá của cao dịch chiết từ củ hành tăm Allium schoenoprasum


MỤC LỤC
MỤC LỤC I
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT V
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU . VI
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ . VIII
LỜI MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. GIỚI THIỆU VỀ HÀNH TĂM 3
1.1.1. Chi Hành 3
1.1.2. Giới thiệu về hành tăm 4
1.1.3. Các thành phần có trong hành tăm và công dụng của hành tăm .6
1.1.3.1. Các thành phần có trong hành tăm .6
1.1.3.2. Công dụng của hành tăm 6
1.1.3.3. Hành tăm có trong một số bài thuốc dân gian 7
1.2. MỘT SỐ CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ THỰC VẬT 9
1.2.1. Phân loại các chất có hoạt tính sinh học từ thực vật .9
1.2.2. Một số chất có hoạt tính sinh học từ thực vật 11
1.2.2.1. Một số chất tự nhiên có hoạt tính kháng visinh vật từ thực vật 11
1.2.2.2. Một số chất tự nhiên có hoạt tính chống oxi hóa từ thực vật .12
1.2.3. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về các chất có hoạt tính sinh học từ
thực vật 13
1.3. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT CÁC HỢP CHẤT HỮUCƠ .15
1.3.1 Tách chiết bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước .15
1.3.3. Một số phương pháp tách chiết mới 18
1.4. MỘT SỐ QUÁ TRÌNH XẢY RA TRONG TÁCH CHIẾT CÁC HỢP CHẤT 20
1.4.1. Quá trình khuếch tán .20
1.4.1.1. Khuếch tán phân tử .20
1.4.1.2. Khuếch tán đối lưu .21
1.4.2. Quá trình thẩm thấu .21
1.4.3. Quá trình thẩm tích 21
-ii-
1.5. GIỚI THIỆU VỀ MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT 22
1.5.1. Đặc điểm chung của phương pháp sắc kí 22
1.5.2. Cơ sở của phương pháp sắc kí .22
1.5.3. Phân loại các phương pháp sắc kí .22
1.6. VI SINH VẬT TRONG ĐỜI SỐNG CON NGƯỜI VÀ CÁC LOẠI NHIỄM ĐỘC
THỰC PHẨM DO VI SINH VẬT 23
1.6.1. Vi sinh vật trong đời sống con người 23
1.6.2. Nhiễm độc từ thực phẩm và nhiễm độc tố từ visinh vật 24
1.6.3. Nguồn gốc nhiễm bệnh 24
1.6.4. Sơ lược về đặc tính của các chủng vi sinh vật thử nghiệm .25
1.7. CÁC NGHUYÊN TẮC BẢO QUẢN THỰC PHẨM .28
1.7.1. Nguyên tắc Bioza (Bios = sống) 28
1.7.2. Nguyên tắc Abioza (Abiosis = không sống) . 28
1.7.3. Nguyên tắc Anabioza (= giảm sự sống) 29
CHƯƠNG II
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU 32
2.1.1. Nguyên liệu 32
2.1.2. Các chủng vi sinh vật kiểm định .32
2.1.3. Hóa chất sử dụng .33
2.1.4. Thiết bị sử dụng .34
2.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .35
2.2.1. Phương pháp phân tích hóa học 35
2.2.2. Phương pháp đánh giá cảm quan .35
2.2.3. Phương pháp thu mẫu và xử lý mẫu 35
2.2.4. Các phương pháp tách chiết 36
2.2.5.1. Nhân giống và hoạt hóa vi sinh vật kiểm định .36
2.2.5.2. Xác định mật độ tế bào .36
2.2.5.3. Thử khả năng kháng vi sinh vật bằng phươngpháp cấy ria .37
2.2.5.4. Thử khả năng kháng vi sinh vật bằng phươngpháp đục lỗ 37
2.2.6. Xác định khả năng chống oxi hóa của cao dịchchiết .37
2.2.7. Nghiên cứu thử nghiệm khả năng bảo quản tôm của cao dịch chiết .37
-iii-
2.2.8. Xác định thành phần các chất có trong cao dịch chiết 37
2.2.9. Phương pháp bố trí thí nghiệm 38
2.2.9.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát .38
2.2.9.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn nhiệt độ sấy nguyên liệu 40
2.2.9.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn phương pháp chiết .41
2.2.9.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn dung môi táchchiết .41
2.2.9.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn dung môi táchchiết .42
2.2.9.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định hoạt tínhkháng vi sinh vật và chống oxi hóa
của cao dịch chiết 42
2.2.9.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định hoạt tínhkháng vi sinh vật và chống oxi hóa
của cao dịch chiết 43
2.3. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 43
CHƯƠNG III
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. KẾT QUẢ XỬ LÝ NGUYÊN LIỆU HÀNH TĂM .44
3.2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT CAO DỊCH TỪ CỦ HÀNH TĂM 45
3.2.1. Tách chiết bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước 45
3.2.2. Tách chiết bằng phương pháp Soxhlet 47
3.3. NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG VI SINH VẬT CỦA CÁC CAO DỊCH 48
3.3.1. Xác định bằng phương pháp cấy ria 48
3.3.1.1. Xác định khả năng kháng vi khuẩn 48
3.3.1.2. Xác định khả năng kháng nấm mốc .51
3.3.2. Nghiên cứu khả năng kháng vi sinh vật bằng phương pháp đục lỗ 52
3.3.2.1. Đánh giá định tính khả năng kháng vi khuẩn . 52
3.3.2.2. Đánh giá định tính khả năng kháng nấm mốc 54
3.3.3. Đánh giá định lượng khả năng kháng 7 chủng vi khuẩn .57
3.3.4. Xác định liều lượng nhỏ nhất của cao dịch chiết có khả năng kháng vi khuẩn 62
3.3.4.1. Xác định MIC của cao dịch chiết kháng vi khuẩn B. cereus BK7 .62
3.3.4.2. Xác định MIC của cao ethanol kháng 05 chủng vi khuẩn 63
3.3.4.3. Xác định MIC của cao n-hexan kháng 05 chủng vi khuẩn 65
3.4. XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG CHỐNG OXI HÓA CỦA CÁC CAO DỊCH CHIẾT 67
3.5. THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG BẢO QUẢN TÔM CỦA CÁC CAO DỊCH .70
-iv-
3.6. XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN CÁC CHẤT CÓ TRONG CAO DỊCHCHIẾT 72
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
TÀI LIỆU THAM KHẢO . 77
PHỤ LỤC 1. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 81
PHỤ LỤC 2. CÁC KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 93


LỜI MỞ ĐẦU
Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới với nguồndược liệu rất phong phú
và đa dạng. Theo số liệu thống kê gần đây, hệ thực vật Việt Nam có trên 10000 loài và
theo Võ Văn Chi nước ta có khoảng 3200 loài cây thuốc.
Thuốc chữa bệnh là một thành phần không thể thiếu được trong cuộc sống. Từ xa
xưa cho đến hiện nay, con người đã biết sử dụng cáccây cỏ vào việc điều trị bệnh.
Mặc dù các loại thuốc tây y chiếm một phần lớn trong phương pháp điều trị nhưng
thuốc có nguồn gốc thảo dược vẫn đứng một vị trí hết sức quan trọng.
Trên thế giới, nguồn thực vật vô cùng phong phú nhưng mới chỉ có khoảng 5-
10% tổng số loài được nghiên cứu làm nguyên liệu chữa bệnh và cho mục đích tìm
kiếm chất mới có hoạt tính sinh học.
Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa với thảm thực vật phong phú
(khoảng 4000 loài thực vật bậc cao, trong đó có khoảng hơn 300 loài được sử dụng
phổ biến thuộc 270 họ). Việc nghiên cứu thuốc ở nước ta những năm gần đây đã có
nhiều bước phát triển. Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các
loài thực vật giúp các nhà khoa học tìm hiểu sâu hơn và sử dụng hiệu quả hơn nguồn
dược liệu sẵn có, đồng thời góp phần thúc đẩy ngànhcông nghiệp Hóa dược trong
nước phát triển, khoa học hóa nền Y học Cổ truyền.
Các hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm hiện nay là đối tượng được
nghiên cứu rất nhiều, đặc biệt hướng tách chiết chúng từ các loại cây cỏ, thảo dược và
ứng dụng vào trong y học. Từ thực tế đó đề tài: “Nghiên cứu tách chiết và khảo sát
hoạt tính kháng khuẩn – chống oxi hoá của cao dịch chiết từ củ hành tăm Allium
schoenoprasum”là một hướng nghiên cứu cần thiết.
Mục đích của đề tài:
Tách chiết được các chất có hoạt tính sinh học từ củ hành tăm Allium
schoenoprasumđồng thời khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, hoạt tính chống
oxi hóa của chúng để làm cơ sở cho việc ứng dụng vào trong y học và đời sống con
người.
Nội dung nghiên cứu:
1) Nghiên cứu phương pháp xử lý nguyên liệu hành tăm.
2) Nghiên cứu các điều kiện thích hợp thu nhận những hoạt chất có tính kháng
khuẩn và hoạt tính chống oxi hóa từ củ hành tăm: lựa chọn phương pháp chiết, dung
môi chiết, .
-2-
3) Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn và hoạt tính chống oxi hóa của các hợp chất
chiết từ củ hành tăm.
4) Khảo sát khả năng ứng dụng bảo quản thực phẩm của các hợp chất chiết từ củ
hành tăm.
Ý nghĩa khoa học của đề tài.
Lần đầu tiên nghiên cứu một cách có hệ thống từ việc tìm chọn các thông số cho
việc tách chiết các chất có hoạt tính sinh học từ củ hành tăm, vì vậy là nguồn bổ sung
các tư liệu có tính khoa học về các tính chất dược lý của củ hành tăm. Các kết quả thu
được của đề tài sẽ bổ sung hữu ích nguồn tài liệu phong phú cho các nhà nghiên cứu
các chất có hoạt tính sinh học từ thực vật.
Ý nghĩa thực tiễn của đề tài:
Kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở cho các nhà thực nghiệm thử nghiệm sử
dụng các chất có hoạt tính sinh học được tách chiếttừ củ hành tăm trong y, dược học
và đời sống con người, góp phần nâng cao giá trị sửdụng của củ hành tăm.
-3-
CHƯƠNG I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. GIỚI THIỆU VỀ HÀNH TĂM
1.1.1. Chi Hành
Là chi thực vật có chứa hành, tỏi với khoảng 1.250 loài, thông thường được phân
loại trong họ Hành (Alliaceae) của chính chúng. Mộtsố nhà thực vật học đã từng phân
loại nó trong họ Loa kèn (Liliaceae).
Chúng là các loại thực vật sống lâu năm có thân phình ra thành củ giống như củ
hành. Chúng phát triển tốt trong vùng ôn đới của Bắc bán cầu, ngoại trừ một số loài có
mặt ở Chile (loài Allium juncifolium), Brazil (loài Allium sellovianum) hoặc nhiệt đới
châu Phi (loài Allium spathaceum). Chiều cao thân cây của chúng dao động từ 5-150
cm. Các hoa tạo thành dạng hoa tán ở trên đỉnh của thân cây không có lá. Các chồi
(thân cây có lá đã biến đổi hay các gốc lá dày dặc,trong cách gọi thông thường là củ)
dao động về kích thước giữa các loài, từ rất nhỏ (đường kính khoảng 2-3 mm) đến rất
lớn (8-10 cm). Một số loài (chẳng hạn hành tăm A.schoenoprasum) phát triển các gốc
lá dày dặc chứ không tạo ra chồi như những loài khác.
Phần lớn các chồi cây trong các loài thuộc chi hànhđều gia tăng bằng cách tạo ra
các chồi nhỏ hay "mầm cây”xung quanh chồi già, cũngnhư bằng cách phát tán hạt.
Một vài loài có thể tạo ra nhiều củ (quả) nhỏ trongcụm hình đầu ở gốc lá; tạo ra cụm
nhỏ gọi là "mắt hành (tỏi)”(chẳng hạn A.cepanhóm Proliferum). Các mắt này có thể
phát triển thành cây. Chi này chứa một số loài cây có giá trị như hành, hẹ tây, tỏi tây,
tỏi và hành tăm. Mùi của "hành”là đặc trưng cho cả chi, nhưng không phải mọi loài
đều có mùi giống nhau. Một số loài Alliumbị ấu trùng của một số loài nhạy thuộc bộ
cánh vẩy (Lepidoptera) ăn hại [9].
Một số loài thuộc chi hành.


TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt.
1. Tô Kim Anh, “Thí nghiệm hóa sinh công nghiệp”, ViệnCông Nghệ Sinh Học
và Thực Phẩm, bộ môn hóa sinh, trường Đại học Bách khoa, Hà Nội, 1997.
2. Hoàng Minh Châu, Từ Văn Mặc, Từ Vọng Nghi, “Cơ sở hóa học phân tích”,
Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, 2002.
3. Đặng Xuân Cường, “Nghiên cứu thu nhận dịch chiết cóhoạt tính kháng
khuẩn từ rong nâu Dictyota dichotomaViệt Nam”, Luận văn Thạc sỹ kỹ thuật, Đại học
Nha Trang, 2009.
4. Nguyễn Văn Đàn, Ngô Ngọc Khuyến, “Hợp chất thiên nhiên dùng làm
thuốc”, Nhà xuất bản Y học Hà Nội, 1991.
5. Lê Tự Hải, “Nghiên cứu tách chiết và xác định thànhphần hóa học cao dich
dịch chiết từ cây pơmu Quảng Nam”, luận văn thạc sỹ, Đại học Đà Nẵng, 2007.
6. Nguyễn Thị Thu Hằng, “Nghiên cứu tách chiết và xác định hàm lượng axit
trong vỏ quá bứa khô”, Đại học Đà Nẵng, 2008.
7. Nguyễn Thị Hiền, “Vi sinh vật nhiễm tạp trong lươngthực thực phẩm”, Đại
học Bách Khoa Hà Nội, 2009.
8. Phạm Hoàng Hộ, “Cây cỏ Việt Nam”, Quyển I, Nhà xuấtbản trẻ, 1999.
9. Trần Việt Hưng, “Từ điển thảo mộc dược học”, Nhà xuất bản y học, 1999.
10. Lê Khả Kế, “Cây cỏ thường thấy ở Việt Nam”, tập II, Nhà xuất bản khoa học
và kĩ thuật, 1971. (305-310)
11. Từ Văn Mặc, “Phân tích hóa lý phương pháp phổ nghiệm nghiên cứu cấu trúc
phân tử”, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, 2003.
12. Lã Đình Mỡi, “Tài nguyên thực vật Việt Nam, những cây có chứa các hợp
chất có hoạt tính sinh học”, Nhà xuất bản Nông nghiệp Hà Nội, 2005.
13. Nguyễn Thu Phương, “Nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc hóa học của
một số hợp chất thuộc lớp chất tecpenoit từ cây Mỡ Phú Thọ (Manglietia phuthoensis
Dandy)”, Luận văn thạc sỹ, Đại học bách khoa Hà Nội, 2007.
14. Đỗ Việt Phương, “Nghiên cứu thu nhận một số chất mầu có nguồn gốc thiên
nhiên và ứng dụng trong chế biến các sản phẩm mô phỏng từ surimi”, Luận văn Thạc
sỹ kỹ thuật, Đại học Nha Trang, 2005.
15. Phan Tống Sơn, “Bài giảng hóa học hợp chất thiên nhiên”, 2004.
-78-
16. Trần Linh Thước, “Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm
và mĩ phẩm”, Nhà Xuất Bản Giáo Dục, 2009.
Tài liệu tiếng Anh.
17. Aggarwal BB et al (2003), “Anticancer potenitial of curcumin preclinical and
clinical studies, Anticancer Res 2003”
18. Ammanamanchi S. R. Aujaneyulu, Moturu V. R. Krishnamurthy and
Gottumukkala V. Rao, Rare Aromadendrane, “Deterpenoids from a new soft coral
species of sinularia genus of the India ocean”, Tetrahedron, (1997), 53(27), 9301-9312.
19. Bhabani S. Jena, Guddadarangavvanahally. Jayaprakasha, Kunnumpurath K.
Sakariah, (2002), "Organic Acids from Leaves, Fruits, and Rinds of Garcinia cowa",
Journal of Agricultural and Food chemistry, 50(12),3431-3434.
20. Bringmann G., Saeb W., Assi L.A., Narayanan A.S.S., Peter K., Peter E.M.,
(1997), “Betulinic axit. Isolation from Triphyophyllum peltatum and Ancistrocladus,
Antimalarial Activity, and Crytal Structure of the Benzyl Ester”, Planta Med., 63, 255-257.
21. Burt S. (2004), “Essential oils: their antibacterial properties and potential
applications an food”, International Journal of food Microbiology 94, pp.223-253.
22. Connolly J.D., Hill R.A. and Ngadjiui B.T. (1989),“Triterpenoids”, Natural
Product Reports, 6, 475.
23. Gunenal Z., L. Omur Denurezek, “Flavonol Glycosidefrom Rutaceae”, J.
Chem.29, 2005.
24. James J. Sims and John A. Pettus, “Isolation of free cis and trans-phytol from
the red alga Gracilaria andersoniana”, Phytochemistry, (1976), 15(6), 1076-1077.
25. Jayaprakasha, G. K.; Sakariah, K. K (1998), “Determination of organic acids
in Garcinia cambogia by HPLC”, Journal of Chromatography A, 806(2), 337-339.
26. Kashiwada Y., Hashimoto F., Cosentino L.M., Chem C.H., Garett P.E., Lee
K.H., (1996), “Bectulinic axit and dihydrobectulinic axit derivatives as poten anti-HIV
agents”J. Med. Chem., 39, 1016-1017.
27. Kashiwada Y., Nagao T., Hashimoto A., Okabe H., Cosentino L.M., Fowke
K., Morris-Natschke S.L., Lee K.H., Ikeshiro Y., (2000) “Anti-AIDS agents, 38 Anti-HIV activity of 30 O-Acyl ursonic axit derivatives”J. Nat. Prod., 63, 1619-1622.
-79-
28. Kouki ONO, Naho SUGIHARA, Yuko HIROSE, Kumiko KATAGIKI
(2003), An examination of optimal extraction solvents for anthocyanin pigments from
Black Rice produced in Gifu, Gifu City Women’s Research Bulletin.
29. Lesueur D., Ninh Khac Ban, Ange Bighelli, Alain Muselli and Joseph
Casanova (2006), “Analysis of the root oil of Fokienia hodginsii (Dunn) Henry et
Thomas (Cupressaceae) by GC, GC–MS and 13C-NMR”, Flavour And Fragrance
Journal, 21: 171-174
30. Li Huang, Chin Ho Chen (2002) “Molecular target ofanti-HIV 1 triterpenes”
Current drug target-infection disorder, 2, 33-36.
31. Mahato S.B., Sen S., (1997) “Advances in terpeniods reseach, 1990-1994”,
Phytochemistry, 44, (7), 1185-1236.
32. Mastelic J., 1 O.Politeo, 2 I. Jerkovic, 1 and N.Radosevic3 (2005),
“Composition and antimicrobial activity of Helichrysum italicum essential oil and its
terpene and terpennoid fractions”, Chemistry of Natural Compounds, 41, 1.
33. Prabuseennivasan S., Manickkam Jayakumar and Savarimuthu Ignacimuthu
(2006), “In vitro antibacterial activity of some plant essential oils”, BMC
complemetary and Alternative Medicine, pp.1427-1442.
34. Rasool N., Abdul Qasim Khan, Viqar Uddin Ahmad andAbdul Malik, “A
benzoquinone and a coumestan from Psoralea plicata”, Phytochemistry, (1991), 30(8),
2800-2803.
35. Shane G.Griffin, S. Grant Wyllie, Julie L. Markhamand David N. Leach
(1999), “The role of structure and molecular properties of terpenoids in determining
their antimicrobial activity”, Flavour Fragr.J., 14, pp.322-332.
36. Viloria-Matos, A., M.J. Moreno-Alvarez and D. Hidalgo (2001), “Isolation
and identification of Betacyanin from fruits of Opuntia boldinghii Br. et R. by
HPTLC”, Cienc. Tecnol. Aliment. 3(3):140-143.
37. Weyerstahl P., Helga Marschall, Phan Tong Son, Phan Minh Giang (1999),
“Constituents of Vietnamese pemou oil- a reinvestigation”, Faculty of Chemistry,
University of Hanoi, Vietnam.
-80-
Tài liệu tra cứu trên internet
38. http://www.ioop.org.vn/vn/
39. http://www.monanbaithuoc.com
40. http://www.microbiol.org/
41. http://thuoccotruyen.blogspot.com/
42. http://***********/xem-tai-lieu/tong-quan-ve-cac-chat-co-hoat-tinh-sinh-hoc-trong-thuc-vat.226658.html