Thạc Sĩ Nghiên cứu tách chiết Enzyme Alginate lyase từ vi sinh vật có trong rong biển và bước đầu ứng dụng n

DANH MUÏC CAÙC CHÖÕ VIEÁT TAÉT .4
DANH MUÏC CAÙC BAÛNG BIEÅU, HÌNH VAØ ÑOÀ THÒ 5
MÔÛ ÑAÀU 5
1. Tính caáp thieát cuûa ñeà taøi .7
2. Muïc ñích, nhieäm vuï vaø noäi dung nghieân cöùu cuûa ñeà taøi 8
3. Ñieåm môùi vaø yù nghóa khoa hoïc, thöïc tieãn cuûa ñeà taøi .8
Chương 1. TOÅNG QUAN .9
1.1. Toång quan veà rong Naâu [1] .9
1.2. Toång quan veà Alginate 11
1.2.1. Alginate[1][11] . 11
1.2.2. Coâng thöùc caáu taïo cuûa axit alginic vaø muoái alginate [1],[11] 12
1.2.2.1. Ñaëc ñieåm, caáu taïo cuûa Alginic 12
1.2.2.2. Ñaëc ñieåm, caáu taïo cuûa caùc keo Alginate. 14
1.2.3. Tính chaát cuûa moät soá loaïi keo Alginate . 15
1.3 Moät soá nghieân cöùu veà alginate lyase .18
1.4. Nhöõng nghieân cöùu veà Oligo alginate (OA) .19
1.4.1. Nhöõng nghieân cöùu trong nöôùc 19
1.4.2. Nhöõng nghieân cöùu ngoaøi nöôùc 21
1.5. Toång quan sô löôïc veà caùc phöông phaùp nghieân cöùu .23
1.5.1. Phöông phaùp phaân laäp vi sinh vaät[6],[8] 23
1.5.2. Phöông phaùp baûo quaûn gioáng vi sinh vaät . 23
1.5.3. Phöông phaùp nghieân cöùu hình thaùi vi sinh vaät.[6] 24
1.5.4. Phöông phaùp nuoâi caáy vi sinh vaät sinh enzyme vaø thu nhaän cheá phaåm
enzyme[3][4][5][7] . 25
1.5.4.1. Phöông phaùp nuoâi caáy .25
1.5.4.2. Thu hoài cheá phaåm enzyme 26
Chöông 2. NOÄI DUNG VAØ PHÖÔNG PHAÙP NGHIEÂN CÖÙU .28
2.1. Noäi dung nghieân cöùu. 28 2
2.2. Caùc phöông phaùp nghieân cöùu[3][6][7][8] .29
2.3. Phöông phaùp boá trí thí nghieäm 29
2.3.1. Boá trí nghieäm phaân laäp chuûng vi khuaån trong töï nhieân coù khaû naêng sinh
toång hôïp algL . 29
2.3.2. Sô ñoà boá trí thí nghieäm löïa choïn chuûng vi sinh vaät coù khaû naêng sinh toång
hôïp algL cao . 30
2.3.3. Sô ñoà boá trí thí nghieäm kieåm tra tính thuaàn khieát cuûa chuûng vi sinh vaät
ñöôïc löïa choïn . 32
2.3.4. Sô ñoà boá trí thí nghieäm thu dòch enzyme algL töø moâi tröôøng sinh khoái . 33
2.3.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm thử nghiệm phaân caét caùc loại Natri alginate khaùc
nhau bằng dung dịch enzyme thu được . 34
2.3.6. Sô ñoà boá trí thí nghieäm xaùc ñònh hoaït ñoä enzyme 35
2.3.7. Sô ñoà boá trí thí nghieäm phaân aûnh höôûng cuûa thôøi gian nuoâi caáy ñeán söï
phaùt trieån cuûa vi sinh vaät vaø khaû naêng phaân caét cuûa algL . 36
2.3.8. Sô ñoà boá trí thí nghieäm nghieân cöùu aûnh höôûng cuûa caùc hôïp chaát kim loaïi
ñeán khaû naêng phaân caét cuûa algL 38
Sô ñoà 2.3.8: AÛnh höôûng cuûa caùc hôïp chaát kim loaïi ñeán khaû naêng phaân caét cuûa algL . 38
2.3.9. Sô ñoà boá trí thí nghieäm nghieân cöùu aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä ñeán khaû
naêng phaân caét cuûa algL 39
2.3.10. Sô ñoà boá trí thí nghieäm choïn taùc nhaân keát tuûa thích hôïp ñeå thu hoài algL
töø dòch enzyme . 40
Chöông 3. KEÁT QUAÛ NGHIEÂN CÖÙU VAØ THAÛO LUAÄN .41
3.1. Keát quaû nghieân cöùu phaân laäp chuûng vi sinh vaät trong töï nhieân coù khaû naêng
sinh toång hôïp enzyme algL 41
3.2. Kết quả thí nghiệm lựa chọn chủng vi sinh vật coù khả năng sinh algL cao 42
3.3. Keát quaû thí nghieäm kieåm tra tính thuaàn khieát cuûa vi sinh vaät ñaõ choïn .44
3.4. Keát quaû thí nghieäm phaân caét caùc loaïi natri alginate baèng dung dòch
enzyme thu ñöôïc .45 3
3.5 Keát quaû ñònh danh vi sinh vaät .47
3.5.2. Keát quaû nhuoäm Gram vaø sinh hoùa ñònh danh baèng heä thoáng IDS14GNR 48
3.5.3. Keát quaû giaûi trình töï gene 16S treân maùy CEQ 8000 vaø tra cöùu treân
BLAST SEARCH . 49
3.6. Keát quaû thí nghieäm xaùc ñònh hoaït ñoä enzyme 51
3.7. Keát quaû thí nghieäm aûnh höôûng cuûa thôøi gian nuoâi caáy ñeán söï phaùt trieån
cuûa vi sinh vaät vaø khaû naêng phaân caét cuûa algL do vi sinh vaät sinh ra 53
3.8. Keát quaû thí nghieäm nghieân cöùu aûnh höôûng cuûa caùc ion kim loaïi ñeán khaû
naêng phaân caét cuûa algL 54
3.9. Keát quaû nghieân cöùu aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä ñeán khaû naêng phaân caét cuûa
algL .56
3.10. Keát quaû thí nghieäm choïn taùc nhaân keát tuûa thích hôïp ñeå taùch chieát algL töø
dòch enzyme 58
3.11. Ñeà xuaát quy trình thu hoài cheá phaåm enzyme algL töø vi khuaån Klebsiella
sp 60
Chöông 4. KEÁT LUAÄN VAØ ÑEÀ XUAÁT YÙ KIEÁN .63
4.1. Keát luaän .63
4.2. Ñeà xuaát yù kieán .64
TAØI LIEÄU THAM KHAÛO . 66
PHUÏ LUÏC 1. CAÙC KEÁT QUAÛ NGHIEÂN CÖÙU 70
PHUÏ LUÏC 2. HOÙA CHAÁT VAØ THIEÁT BÒ SÖÛ DUÏNG TRONG LUAÄN VAÊN 75 4
DANH MUÏC CAÙC CHÖÕ VIEÁT TAÉT
E: Enzyme
S: Cô chaát Na-alginate
dd: dung dòch
OA: Oligo Alginate
vsv: vi sinh vaät
algL: Alginate lyase
Na-alg: Natri alginate
EDTA: Ethylene diamine tetraacetic acid 5
DANH MUÏC CAÙC BAÛNG BIEÅU, HÌNH VAØ ÑOÀ THÒ
STT TEÂN BAÛNG Trang
1 Baûng 1.2.3. Nhieät ñoä phaân huûy cuûa caùc loaïi Alginte khaùc nhau 16
2 Bảng 1.4.1. AÛnh höôûng cuûa noàng ñoä oligo alginate ñeán khaû
naêng naûy maàm cuûa haït thoùc gioáng
19
3 Baûng 3.4. Möùc ñoä hao toån ñoä nhôùt cuûa caùc dung dòch Na-
alginate khaùc nhau
44
4 Baûng 3.5.2. Keát quaû thöû nghieäm sinh hoùa ñònh danh 47
5 Bảng 3.10. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt động của alginate
lyase
55
TEÂN HÌNH
1
Hình 1.2.2.1a :Coâng thöùc coå ñieån cuûa hai ñôn vò monomeric
trong axit Alginic 12
2 Hình 1.2.2.1b: Hình theå daïng gheá cuûa axit Uronic 13
3 Hình 1.2.2.1c: Caáu taïo cuûa axit Alginic 13
4 Hình 1.2.2.1d: Caáu taïo axit alginic theo moâ hình caùc coâng thöùc
coå ñieån (coâng thöùc phoái caûnh)
13
5 Hình 1.2.2.2a: Coâng thöùc caáu taïo Na-alginate 14
6 Hình 1.2.2.2b: Coâng thöùc caáu taïo Ca-alginate 15
7 Hình 1.4.2a: Aûnh höôûng cuûa hoãn hôïp Oligomanuronate (Oligo-
M) chöa baûo hoaø vaø hoãn hôïp Oligoguluronate (Oligo-G) chöa
baûo hoaø leân söï daøi ra cuûa reå caây caø roát vaø caây luùa
20
8 Hình 1.4.2b: AÛnh höôûng cuûa noàng ñoä hoån hôïp oligo-G ñeán söï
daøi ra cuûa reå caây caøroát vaø luùa .
Hình 1.4.2c: AÛnh höôûng cuûa möùc ñoä ñoàng truøng hôïp oligo-G
ñeán söï daøi ra cuûa reå caây caøroát aø luùa . Ñoä daøi cuûa reå xaùc ñònh
sau 8 vaø 15 ngaøy. (noàng ñoä 0,75mg/ml)
21
9 Hình 3.1a: VSV coù khuaån laïc maøu traéng söõa (C1) 40
10 Hình 3.1b: VSV coù khuaån laïc maøu môõ gaø (C2) 40 6
11 Hình 3.3a. Khuaån laïc vi sinh vaät maøu traéng söõa treân moâi tröôøng
thaïch I
43
12 Hình 3.3b. Khuaån laïc vi sinh vaät maøu traéng söõa treân moâi tröôøng
thaïch chæ coù Na-alginate 1,5% vaø soi döôùi kính hieån vi vaät kính
100x
43
13 Hình 3.5.1. Khuaån laïc vi sinh vaät phaân laäp treân caùc moâi tröôøng
khaùc nhau
46
14 Hình 3.5.2. Hình aûnh teá baøo vi sinh vaät phaân laäp ñöôïc 47
15 Hình 3.5.3. Sô ñoà giaûi trình töï gene 16S cuûa chuûng vi sinh vaät
phaân laäp
49
TEÂN ÑOÀ THÒ
1
Ñoà thò 3.2. Möùc ñoä hao toån ñoä nhôùt cuûa dung dòch Na-alginate
1% theo thôøi gian phaân caét
41
2
Ñoà thò 3.4. Möùc ñoä hao toån ñoä nhôùt cuûa caùc dd Na-alginate 1%
khaùc nhau theo thôøi gian phaân caét
44
3
Ñoà thò 3.6a. Möùc ñoä hao huït ñoä nhôùt cuûa dung dòch Na-alginate
1% theo noàng ñoä Enzyme 50
4 Ñoà thò 3.6b. Möùc ñoä hao huït ñoä nhôùt cuûa dung dòch Na-
alginate 1% theo noàng ñoä Enzyme
51
5
Ñoà thò 3.7. AÛnh höôûng cuûa thôøi gian nuoâi caáy ñeán söï phaùt trieån
cuûa Klebsiella sp vaø hoaït ñoä enzyme algL
52
6 Ñoà thò 3.8. AÛnh höôûng caùc ion kim loaïi ñeán hoaït löïc cuûa
enzyme algL
53
7 Ñoà thò 3.9. AÛnh höôûng cuûa nhieät ñoä ñeán khaû naêng phaân caét cuûa
enzyme algL
55 7
MÔÛ ÑAÀU
1. Tính caáp thieát cuûa ñeà taøi
Rong bieån laø nguoàn lôïi bieån cung caáp caùc chaát keo quan troïng nhö
Agar, Alginate, Carrageenan duøng trong coâng ngheä thöïc phaåm vaø caùc ngaønh
coâng nghieäp khaùc. Treân theá giôùi töø nhöõng naêm 1980 rong bieån ñaõ ñöôïc quan
taâm nghieân cöùu. Naêm 1930 coâng ngheä cheá bieán caùc chaát Alginate, Manitol,
Agar phaùt trieån maïnh vaø ngaøy caøng öùng duïng nhieàu trong thöïc teá, ñaëc bieät laø
ôû caùc nöôùc Nhaät Baûn, Myõ vaø Trung Quoác. Theo Luning (1990) toång saûn löôïng
cuûa Alginate laø 35.000 taán.[1]
Treân theá giôùi coù nhieàu coâng trình nghieân cöùu öùng duïng cuûa Alginate
trong caùc ngaønh coâng nghieäp nhö: Thöïc phaåm, döôïc phaåm, myõ phaåm, coâng
ngheä deät, noâng nghieäp, coâng ngheä sinh hoïc, nghieân cöùu khoa hoïc
Keát quaû cuûa caùc coâng trình nghieân cöùu öùng duïng alginate trong noâng
nghieäp cho thaáy raèng, maïch alginate sau khi caét maïch coù taùc duïng kích thích
söï sinh tröôûng vaø phaùt trieån ñoái vôùi caây troàng [9][10][12][13][14]. Vôùi öùng
duïng naøy, thieát nghó vieäc nghieân cöùu caùc phöông phaùp caét maïch alginate ñeå
saûn xuaát cheá phaåm kích thích taêng tröôûng thöïc vaät laø raát caàn thieát nhaèm taêng
naêng suaát caây troàng vaø taïo ra caùc saûn phaåm coù giaù trò toát töø ñoù naâng cao giaù trò
kinh teá laø moät höôùng quan troïng ñang ñöôïc caùc nhaø khoa hoc Vieät Nam quan
taâm. Chính vì leõ ñoù, ñeà taøi “ Nghieân cöùu taùch chieát Enzyme Alginate lyase töø
vi sinh vaät coù trong rong bieån vaø böôùc ñaàu öùng duïng noù ñeå thuyû phaân
alginate” laø raát caàn thieát, goùp phaàn öùng duïng coâng ngheä sinh hoïc vaøo noâng
nghieäp vaø ñôøi soáng saûn xuaát ôû nöôùc ta. 8
2. Muïc ñích, nhieäm vuï vaø noäi dung nghieân cöùu cuûa ñeà taøi

Muïc ñích, nhieäm vuï
Ñeà taøi nhaèm phaân laäp, tuyeån choïn chuûng vi sinh vaät trong tự nhieân coù
khaû naêng sinh toång hôïp alginate lyase cao. Tieán haønh nuoâi caáy chuûng vi sinh
vaät ñaõ tuyeån choïn trong moâi tröôøng thích hôïp sau ñoù löïa choïn phöông phaùp
thích hôïp ñeå thu nhaän cheá phaåm alginate lyase töø moâi tröôøng nuoâi caáy vaø böôùc
ñaàu nghieân cöùu öùng duïng caét maïch alginate.
Xaùc ñònh hoaït ñoä cuûa enzyme alginate lyase theo phương phaùp ño độ
nhớt dung dịch alginate 1% trước vaø sau khi phaân caét.
3. Ñieåm môùi vaø yù nghóa khoa hoïc, thöïc tieãn cuûa ñeà taøi

Ñieåm môùi cuûa ñeà taøi
Ñaây laø moät trong nhöõng nghieân cöùu ñaàu tieân veà phaân caét alginate baèng
phöông phaùp sinh hoïc.
Enzyme alginate lyase coù theå öùng duïng ñöôïc vaøo noâng nghieäp ñeå saûn
xuaát ra cheá phaåm taêng tröôûng thöïc vaät ít ñoäc haïi cho con ngöôøi vaø goùp phaàn
giaûm laøm giaûm oâ nhieãm moâi tröôøng.

YÙ nghóa khoa hoïc vaø thöïc tieãn
Keát quaû cuûa ñeà taøi goùp phaàn laøm phong phuù theâm nhöõng hieåu bieát veà
coâng ngheä sinh hoïc vaø öùng duïng cuûa noù vaøo caùc lónh vöïc cuûa ñôøi soáng xaõ hoäi
ñaëc bieät laø trong coâng ngheä saûn xuaát enzyme, noâng nghieäp vaø moät soá ngaønh
coâng nghieäp khaùc.
Keát quaû cuûa ñeà taøi cuõng môû roäng ñaàu ra cho ngaønh coâng nghieäp
alginate cuûa Vieät Nam. Beân caïnh ñoù caùc coâng ty saûn xuaát thuoác taêng tröôûng
thöïc vaät cuõng coù theå öùng duïng ñeå saûn xuaát ra moät cheá phaåm taêng tröôûng thöïc
vaät ít gaây ñoäc haïi cho con ngöôøi vaø moâi tröôøng. 9
Chöông 1
TOÅNG QUAN
1.1. Toång quan veà rong Naâu [1]
 Ngaønh rong Naâu laø moät trong nhöõng ngaønh coù giaù trò kinh teá cao. Rong
Naâu coù treân 190 chi, hôn 900 loaøi, phaàn lôùn soáng ôû bieån, soá loaøi vaø soá chi tìm
thaáy trong nöôùc ngoït khoâng nhieàu laém. Rong coù caáu taïo nhieàu teá baøo daïng
maøng giaû, daïng phieán, daïng sôïi ñôn giaûn, moät haøng teá baøo chia nhaùnh, daïng
oáng hoaëc phaân nhaùnh phöùc taïp hôn daïng caây coù goác, reã, thaân, laù. Rong sinh
tröôûng ôû ñænh, ôû giöõa, ôû goác caùc loùng. Ngoaøi ra, do caùc teá baøo rong daïng phieán
chia caét sinh tröôûng khueách taùn goïi laø sinh tröôûng beà maët.
 Thaønh phaàn hoaù hoïc cuûa rong Naâu
+ Saéc toá
Saéc toá rong Naâu laø dieäp luïc toá (Chlorophyl), dieäp hoaøng toá
(Xanthophyl), saéc toá maøu naâu (Fucoxanthin), saéc toá ñoû (Caroten). Tuyø theo tyû
leä caùc loaïi saéc toá maø rong coù maøu töø naâu – vaøng naâu – naâu ñaäm – vaøng luïc.
Nhìn chung saéc toá cuûa rong Naâu khaù beàn.
+ Gluxit
ư Monosachride
Monosacharide quan troïng trong rong Naâu laø ñöôøng Manitol ñöôïc
Stenhouds phaùt hieän naêm 1884 vaø ñöôïc Kylin (1913) chöùng minh theâm.
Manitol coù coâng thöùc toång quaùt laø : HOCH 2 – (CHOH) 4 – CH 2 OH
Manitol tan ñöôïc trong ancol, deã tan trong nöôùc coù vò ngoït. Haøm löôïng
töø 14 ư 25% troïng löôïng khoâ tuyø thuoäc vaøo ñieàu kieän soáng.
ư Polysacharide 10

Alginic: laø moät polysacharide taäp trung giöõa ôû vaùch teá baøo, laø thaønh
phaàn chuû yeáu taïo thaønh taàng beân ngoaøi cuûa maøng teá baøo rong Naâu
Alginic vaø muoái cuûa noù coù nhieàu coâng duïng trong ngaønh coâng nghieäp,
noâng hoïc, y hoïc vaø thöïc phaåm.
Haøm löôïng Alginic trong caùc loaïi rong Naâu khoaûng 2 ư 4% so vôùi rong
töôi vaø 13 ư 15% so vôùi rong khoâ. Haøm löôïng phuï thuoäc vaøo loaïi rong, ñieàu
kieän ñòa lyù moâi tröôøng maø rong sinh soáng. Theo taøi lieäu toång keát cuûa Miyake
(1995) cho thaáy haøm löôïng Alginic trong caùc loaïi rong Naâu ôû caùc vuøng bieån
Lieân Xoâ cuõ laø 13 ư 40%
Theo taøi lieäu phaân tích cuûa caùc chuyeân gia Boä Thuyû saûn cho thaáy haøm
löôïng Alginic trong caùc loaïi rong Naâu ôû Haûi Phoøng laø 22 ư 40%, trong khi ñoù,
rong Naâu ôû vuøng bieån Phuù Yeân vaø Khaùnh Hoaø cao hôn haún.
Haøm löôïng Alginic coù trong caùc loaøi rong ôû Mieàn Trung Vieät Nam laø
khaù cao, dao ñoäng töø 12,3 ư 39,4% so vôùi troïng löôïng khoâ tuyeät ñoái, tuyø thuoäc
vaøo loaøi vaø vuøng ñòa lyù. Trong ñoù, loaøi rong S. mcclurei vaø Turbinaria ornata
coù haøm löôïng Alginic cao nhaát khoaûng 35,9 ư 39,4% rong khoâ tuyeät ñoái. Neáu
so saùnh taát caùc vuøng bieån thì rong ôû vuøng bieån Khaùnh Hoaø coù haøm löôïng
Alginic cao hôn caû (töø 26,2 ư 39,4% rong khoâ tuyeät ñoái).
ư Axit Fucxinic: coù tính chaát gioáng vôùi axit Alginic. Axit Fucxinic taùc
duïng vôùi axit Sunfuric taïo thaønh hôïp chaát coù maøu tuyø thuoäc vaøo noàng ñoä axit
Sunfuric.
ư Fuccoidin: laø loaïi muoái giöõa axit Fuccoidin vôùi caùc kim loaïi hoaù trò
khaùc nhau nhö Ca, Cu, Zn. Fuccoidin coù tính chaát gaàn gioáng vôùi axit Alginic,
nhöng haøm löôïng thaáp hôn Alginic.
ư Laminarin: Laminarin laø tinh boät cuûa rong Naâu, thöôøng gaëp ôû daïng boät
khoâng maøu, khoâng muøi vaø coù hai loaïi hoaø tan vaø khoâng hoaø tan trong nöôùc. 11
Laminarin coù haøm löôïng töø 10 ư 15% troïng löôïng rong khoâ tuyø thuoäc vaøo loaïi
rong, vò trí ñòa lyù vaø moâi tröôøng sinh soáng cuûa rong Naâu.
ư Cellulose: laø thaønh phaàn caáu taïo neân voû caây rong. Haøm löôïng Cellulose
trong rong Naâu nhieàu hôn rong Ñoû.
+ Proâteâin: Proâteâin trong rong Naâu khoâng cao laém nhöng khaù hoaøn haûo.
Do vaäy rong Naâu coù theå laøm thöïc phaåm. Proâteâin trong rong Naâu thöôøng ôû
daïng lieân keát vôùi Iod taïo Iod höõu cô coù giaù trò cao nhö: MonoIodInzodizin,
DiIodInzodizin.
Haøm löôïng proâteâin rong Naâu ôû vuøng bieån Nha Trang dao ñoäng 8,05 ư
21,11% so vôùi troïng löôïng khoâ. Haøm löôïng axit amin cuõng ñaùng keå vaø coù giaù
trò cao trong proâteâin cuûa rong bieån.
+ Chaát khoaùng
Haøm löôïng caùc nguyeân toá khoaùng trong rong Naâu thöôøng lôùn hôn nöôùc
bieån. Chaúng haïn: Iod cuûa rong bieån lôùn hôn trong nöôùc bieån töø 80 ư90 laàn.
Haøm löôïng Ba lôùn hôn trong nöôùc bieån laø 1.800 laàn.
Haøm löôïng khoaùng ôû vuøng bieån Nha Trang dao ñoäng trong töø 15,51 ư
46,30% phuï thuoäc vaøo muøa vuï vaø thôøi kyø sinh tröôûng
1.2. Toång quan veà Alginate
1.2.1. Alginate[1][11]
Alginate laø thuaät ngöõ thöôøng duøng cho caùc loaïi muoái cuûa axit alginic,
nhöng cuõng coù theå xem laø taát caû caùc daãn xuaát cuûa axit alginic hay chính baûn
thaân axit alginic. ÔÛ moät soá nôi thì thuaät ngöõ “algin” ñöôïc duøng thay cho
alginate. Alginate toàn taïi trong caùc thaønh teá baøo cuûa rong Naâu döôùi daïng muoái
canxi, Magieâ, natri cuûa axit alginic. Alginate ñöôïc hình thaønh nhôø phaûn öùng
ñoàng truøng hôïp khoâng phaân nhaùnh cuûa axit α – L – guluronic vaø axit β – D –
manuronic. Söï khaùc nhau giöõa caùc block laø veà kích thöôùc vaø söï thay ñoåi caùc 12
ñoaïn manuronic (M) vaø guluronic (G) cuõng nhö söï toàn taïi cuûa caùc block ngaãu
nhieân. Caáu truùc cuûa alginate chòu aûnh höôûng cuûa nguoàn rong bieån cuõng nhö
ñieàu kieän phaùt trieån cuûa rong. Ngöôøi ta raát quan taâm ñeán tyû leä M/G vì noù
quyeát ñònh ñeán tính chaát cuûa gel ñöôïc taïo thaønh. Neáu tyû leä naøy caøng nhoû thì
khaû naêng taïo gel cuûa alginate caøng cao vaø ngöôïc laïi.
Alginate cuõng coù theå ñöôïc sinh toång hôïp töø moät loaïi vi sinh vaät robacter
vinelandii, tuy nhieân saûn phaåm alginate do vi sinh vaät saûn sinh ra coù khaû naêng
taïo gel keùm, ít coù tính thöông maïi neân thöôøng chæ ñöôïc ñeà caäp ñeán trong coâng
taùc giaûng daïy.
1.2.2. Coâng thöùc caáu taïo cuûa axit alginic vaø muoái alginate [1],[11]
1.2.2.1. Ñaëc ñieåm, caáu taïo cuûa Alginic
Alginic thuoäc polysacharide nhöng coù chöùa nhoùm carboxyl (-COOH )
trong phaân töû neân thöôøng goïi laø axit alginic hay polysacharide coù tính axit
yeáu.
Theo Niwa (1940) cho raèng ñôn vò caáu truùc cuûa Alginic laø Uronic coù coâng
thöùc phaân töû laø (C 24 H 30 O 23 ) n , Chapman thì cho raèng Alginic laø daïng truøng hôïp
thoaùt nöôùc cuûa D.Mamuronic coù coâng thöùc (C 5 H 9 O 5 COOH) n vaø coâng thöùc hoaù
hoïc töông ñöông cuûa Alginic laø (C 6 H 8 O 6 ) n . Hai thuyeát töông töï nhau,
n = 80 ư83 do vaäy coù söï truøng hôïp raát lôùn.
III.1.2.2. Moät soá tính chaát cuûa caùc alginate.
Hình 1.2.2.1a :Coâng thöùc coå ñieån cuûa hai ñôn vò monomeric trong axit Alginic 13
Theo caùc taøi lieäu hoaù sinh gaàn ñaây moâ taû caáu taïo cuûa Alginic goàm caùc
axit D.Manuronic lieân keát vôùi L.Lunuronic baèng lieân keát 1 – 4 maïch thaúng
khoâng phaân nhaùnh
Alginic laø polymer goàm nhieàu axit Manuronic (M) keát hôïp vôùi Guluronic
(G) taïo maïch thaúng khoâng phaân nhaùnh vaø coù theå lieân keát theo hình phaúng sau:
Treân phaân töû Alginic, caùc phaân töû M vaø G seõ toå hôïp thaønh caùc block theo
daïng hình sau ñaây:
Hình 1.2.2.1b: Hình theå daïng gheá cuûa axit Uronic
Hình 1.2.2.1d: Caáu taïo axit alginic theo moâ hình caùc coâng thöùc coå ñieån
(coâng thöùc phoái caûnh)
Hình 3: Caáu taïo cuûa Alginic axit Hình 1.2.2.1c: Caáu taïo cuûa axit Alginic 14
1.2.2.2. Ñaëc ñieåm, caáu taïo cuûa caùc keo Alginate.
 Natri Alginate.
Coâng thöùc phaân töû: (C 5 H 7 O 4 COONa) n.
Coâng thöùc caáu taïo:
Hình 1.2.2.1e: G block
Hình 1.2.2.1f: M block
Hình 1.2.2.1g: MG block
Hình 1.2.2.2a: Coâng thöùc caáu taïo Na-alginate 15
 Canxi Algiante.
Coâng thöùc phaân töû: [(C 5 H 7 O 4 COO) 2 Ca)] n.
Coâng thöùc caáu taïo:
 Alginate Amonium
1.2.3. Tính chaát cuûa moät soá loaïi keo Alginate
Muoái alginate cuûa kim loaïi hoaù trò I ( Natri alginate ) deã hoøa tan trong
nöôùc, taïo dung dòch keo nhôùt, coù ñoä dính vaø ñoä nhôùt cao, khi laøm laïnh khoâng
ñoâng vaø khi khoâ trong suoát coù tính ñaøn hoài.
Muoái Alginate cuûa kim loaïi hoùa trò II ( Alginate Canxi, Alginate
Magieâ, ) khoâng hoaø tan trong nöôùc, tuyø theo kim loaïi maø coù maøu khaùc nhau.
Khi muoái aåm thì deûo deã bieán hình, khi khoâ raát cöùng, raát khoù thaám nöôùc, nhôø
coù tính chaát naøy maø Alginate coù raát nhieàu öùng duïng trong caùc lónh vöïc khaùc
nhau.
Boät Alginate deã bò giaûm ñoä nhôùt neáu khoâng ñöôïc baûo quaûn ôû nhieät ñoä
thaáp.
Khaùc vôùi Agar thì khi giaûm nhieät ñoä thì dung dòch Alginate khoâng bò
ñoâng laïi, ngay caû khi laøm laïnh vaø tan giaù thì ñoä nhôùt vaø beà ngoaøi cuõng khoâng
thay ñoåi.
Hình 1.2.2.2b: Coâng thöùc caáu taïo Ca-alginate 16
Propyleneglycol Alginate ( PGA) vôùi 80 – 85% nhoùm -COOH ñöôïc
ester hoaù coù taùc duïng nhoû nhaát vôùi ion Canxi, do ñoù hôïp chaát naøy ñöôïc öùng
duïng trong coâng nghieäp söõa. PGA giaûm tính hoaø tan khi pH moâi tröôøng < 4.
pH = 2 thì PGA bò keát tuûa.
Caùc loaïi Alginate khaùc nhau thì seõ bò phaân huyû ôû caùc nhieät ñoä khaùc
nhau. Theo nghieân cöùu cuûa Kenfikato – Khoa Thuyû saûn Tröôøng Ñaïi hoïc
Hokaido, Nhaät Baûn cho thaáy nhieät phaân huûy cuûa caùc Alginate trong baûng sau:
Alginate Nhieät ñoä phaân huûy ( o C )
Axit Alginic
Na – Alginate (1)
Na – Aginate (2 )
Ca – Algiante
Al – Alginate
Fe – Alginate
186
221,5
231,5
204,5
196
218,5
Baûng 1.2.3. Nhieät ñoä phaân huûy cuûa caùc loaïi Alginate khaùc nhau

Ñoä nhôùt vaø troïng löôïng phaân töû.
Dung dòch Alginate taïo neân ñoä nhôùt cao khi hoaø tan trong nöôùc. Ñoä
nhôùt cuûa noù taêng theo noàng ñoä Alginate hoaø tan vaø giaûm theo chieàu taêng cuûa
nhieät ñoä. Troïng löôïng phaân töû trung bình cuûa Alginate ñöôïc ño baèng ñoä nhôùt
vaø khaû naêng thaåm thaáu theo phöông trình sau ñaây:
η = K.M γ
Trong ñoù:
η: ñoä nhôùt
M: khoái löôïng phaân töû trung bình
K, γ : heä soá thöïc nghieäm. 17
Troïng löôïng phaân töû trung bình cuûa Alginate ñöôïc xaùc ñònh baèng phöông
phaùp ñoä nhôùt (Viscometric method). 18
1.3 Moät soá nghieân cöùu veà alginate lyase
R. Scott Doubet vaø Ralph S. Quatrano (1982), thuoäc tröôøng Ñaïi hoïc
Oregen State. Nghieân cöùu phaân laäp caùc vi khuaån bieån coù khaû naêng sinh Lyase
ñaëc hieäu caét maïch Alginate. Cho thaáy caùc Alginate lyase ñöôïc chieát ruùt töø
moâi tröôøng cuûa moät soá vi sinh vaät ñaõ ñöôïc phaân laäp. Caùc lyase naøy ñöôïc sinh
ra nhôø moâi tröôøng coù alginate töï nhieân vaø coù hoaït tính vôùi caû block cuûa axit
manuronic vaø axit guluronic cuûa chuoãi polymer alginate. Lyase ñaëc hieäu ñoái
vôùi axit guluronic ñöôïc taùch chieát töø moâi tröôøng, trong khi ñoù lyase ñaëc hieäu
vôùi axit manuronic ñöôïc taùch chieát töø teá baøo vi khuaån.[20]
Naêm 1992, Manabu Kitamikado, Chao-Huang Tseng, Kuniko
Yamaguchi vaø Takashi Nakamura thuoäc tröôøng Ñaïi hoïc Fukuoka, Nhaät Baûn.
Nghieân cöùu hai chuûng vi sinh vaät sinh enzyme alginate lyase. Cho thaáy caùc
algiante lyase ngoaïi baøo ñöôïc tinh saïch töø Vibrio harveyi Al-128 vaø V.
alginolyticus ATCC 17749. Söï hình thaønh enzyme naøy ñaàu tieân caét ñöùt lieân
keát α 1,4 bao goàm caùc ñôn vò L-guluronate vaø sau ñoù laø caét ñöùt caùc lieân keát
beta 1,4 bao goàm caùc ñôn vò D-manuronate. Phaân töû löôïng cuûa enzyme naøy
ñöôïc xaùc ñònh khoaûng töø 47.000 ñeán 57.000 Da vaø coù ñieåm ñaúng ñieän laàn löôït
laø 4,3 vaø 4,6. Enzyme töø chuûng AL-128 haàu nhö hoaït ñoäng ôû moâi tröôøng coù
noàng ñoä NaCl töø 0,3 ñeán 1,0 M. Coøn moâi tröôøng hoaït ñoäng toái thích cuûa
enzyme töø chuûng ATCC 17749 laø söï coù maët cuûa CaCl 2 coù noàng ñoä töø 5 ñeán 10
mM.[17]
Naêm 2000, Wataru Hashimoto, Osamu Miyake, Keiko Momma,
Shigeyuki Kawai vaø Kousaku Murata thuoäc tröôøng Ñaïi hoïc Kyoto, Nhaät Baûn.
Nghieân cöùu xaùc ñònh phaân töû löôïng cuûa alginate lyase cuûa Sphingomonas sp.
Chuûng A1 laø moät trong nhöõng enzyme caét maïch Alginate. Keát quaû cho thaáy
alginate bò caét maïch taïo thaønh caùc oligoalginate bôûi ba loaïi enzyme ( A1-I {66 19
kDa}, A1-2 {25 kDa}, A1-3 {40 kDa}) ñöôïc sinh ra töø teá baøo chaát. Caùc
enzyme naøy vaø gene cuûa chuùng ñöôïc phaân laäp töø caùc vi sinh vaät phaùt trieån ôû
vuøng coù maët alginate.[19]
Yuan-Hong Wang, Guang-Li Yu, Xin-Min Wang, Zhi-Hua LV, Xia
Zhao, Zhi Hong Wu, Wei-Shang Ji (2006). Nghieân cöùu söï tinh saïch vaø ñaëc
tính cuûa alginate lyase ñöôïc sinh ra töø Vibrio sp. Cho bieát caùc lyase naøy ñöôïc
tinh saïch bôûi söï keát hôïp giöõa chaát laéng amonium sulfate vaø diethylaminoethyl
trong coät saéc kyù Shephacel. Keát quaû cho thaát phaân töû löôïng cuûa caùc alginate
lyase khoaûng 62,5 kDa, vôùi nhieät ñoä vaø pH hoaït ñoäng toái öu laàn löôït laø 25 0 C
vaø 7,0. Khaû naêng hoaït ñoäng cuûa lyase taêng khi coù maët EDTA vaø Zn 2+ , nhöng
bò kìm haõm bôûi Ba 2+ . Lyase naøy ñaëc hieäu caét ñöùt lieân keát beta-D-1,4
manuronic cuûa chuoãi alginate.
Xiao Ting Fu, Sang Moo Kim (2007), Khoa Sinh hoïc vaø Coâng ngheä
Bieån Tröôøng Ñaïi hoïc Quoác Gia Kangnung, Haøn Quoác, nghieân cöùu tinh saïch
vaø tính chaát cuûa alginate lyase töø vi khuaån bieån Agarivorans albus. Keát quaû
nghieân cöùu cho thaáy raèng alginate lyase laø moät chuoãi polypeptit coù khoái löôïng
phaân töû 60 Kda vaø coù ñieåm ñaúng ñieän laø 5,5 – 5,7. pH vaø nhieät ñoä toái thích
cho hoaït ñoäng cuûa enzyme naøy laàn löôït laø 7,0 vaø 40 0 C. Hoaït löïc cuûa enzyme
bò maát hoaøn toaøn bôûi söï thaåm tích vaø phuïc hoài trôû laïi khi theâm 0,1 M Na + hoaëc
K + .[21]
1.4. Nhöõng nghieân cöùu veà Oligo alginate (OA)
1.4.1. Nhöõng nghieân cöùu trong nöôùc
Năm 2002, Viện Nghiên cứu Hạt nhân Đà Lạt đã sản xuất chế phẩm tăng
trưởng thực vật T&D bằng cách chiếu xạ tia gamma lên phân tử alginate để thu
nhận OA có khối lượng phân tử thấp hơn. 20
Naêm 2002, Traàn Thaùi Hoøa vaø Nguyeãn Thò AÙi Nhung ôû Tröôøng Ñaïi hoïc
Khoa hoïc, Ñaïi hoïc Hueá nghieân cöùu aûnh höôûng cuûa oligo alginate ñeán khaû
naêng naûy maàm cuûa haït thoùc gioáng. Oligoalginate duøng ñeå thí nghieäm ñöôïc taïo
ra baèng 3 phöông phaùp : chieáu xaï, phaân caét baèng kieàm vaø axit maïnh. Keát quaû
nhö sau:[10]
STT
Toå hôïp noàng
ñoä toái öu
Söùc naûy
maàm (%)
Cheânh leäch %
so vôùi maãu ñoái
chöùng
Taêng % so
vôùi ñoái
chöùng
Ñieåm chaát
löôïng caây
maàm
1 A 1 50ppm 92,4 + 10,5 111,3 9
2 A 2 40ppm 91,6 + 9,7 111,8 9
3 A 3 30ppm 94,7 + 12,8 115,6 9
4 Ñoái chöùng 81,9 7
Baûng 1.4.1. AÛnh höôûng cuûa noàng ñoä Oligo alginate ñeán khaû naêng naûy
maàm cuûa haït thoùc gioáng
Naêm 2005 cuõng taïi Tröôøng Ñaïi hoïc Khoa hoïc Hueá, taùc giaû Voõ Thò Mai
Höông cuõng ñaõ nghieân cöùu aûnh höôûng cuûa OA ñeán söï phaùt trieån cuûa moät soá
gioáng caây ngaén ngaøy vaø coù keát luaän nhö sau:
ư Oligoalginate coù khaû naêng kích thích söï sinh tröôûng, taêng söï tích luõy
chaát khoâ vaø naêng ñeû nhaùnh cuûa luùa. Taïi noàng ñoä OA 80 ppm haøm löôïng chaát
khoâ ñaït cao nhaát (taêng 25,40% so vôùi ñoái chöùng), soá nhaùnh/caây cao nhaát (taêng
21,10%) vaø troïng löôïng haït/chaäu cao nhaát (taêng 32,41).
ư OA theå hieän roõ reät taùc duïng kích thích leân sinh tröôûng cuûa caây ngoø.
Noàng ñoä OA toái thích laø 60 ppm. Taïi noàng ñoä naøy troïng löôïng töôi cuûa ngoø
taêng 165,145%, naêng suaát taêng 60,76%. Taát caû caùc loâ coù xöû lyù OA ñeàu coù
naêng suaát cao hôn so vôùi ñoái chöùng. 21
ư OA laøm taêng soá hoa/caây vaø tyû leä hoa höõu hieäu vaø naêng suaát cuûa laïc ôû
taát caûc caùc noàng ñoä nghieân cöùu. Saûn löôïng laïc taêng 1,77 – 7,48 taï/ha vaø ñaït
cao nhaát (26,83 taï/ha, taêng 38,66%) ôû noàng ñoä OA toái thích (80 ppm).
1.4.2. Nhöõng nghieân cöùu ngoaøi nöôùc
Naêm 2003, caùc nhaø nghieân cöùu ôû Tröôøng Ñaïi hoïc Nagasaki, Nhaät Baûn
ñaõ nghieân cöùu khaû naêng kích thích söï phaùt trieån reå caây caø roát vaø luùa cuûa caùc
Oligo uronate chöa baûo hoaø töø alginate. Caùc oligo uronate chöa baûo hoaø ñöôïc
chuaån bò nhôø moät enzyme alginate lyase tieâu hoaù polymannuronate ( PM ) vaø
polyguluronate ( PG ), ñöôïc tinh saïch töø Pseudomonas sp. Söï phaùt trieån cuûa reå
ñöôïc xaùc ñònh bôûi söï daøi ra cuûa reå caây caøroát vaø caây luùa ñöôïc uû trong moâi
tröôøng coù chöùa 0,8% agar trong boùng toái. PG vaø PM khoâng coù khaû naêng kích
thích söï phaùt trieån reå nhöng khi ta troän laãn caùc enzyme tieâu hoaù PG thì noù laïi
coù khaû naêng kích thích söï phaùt trieån cuûa reå cuûa hai loaïi caây naøy ôû noàng ñoä toái
thieåu laø 0,5mg/ml, khaû naêng kích thích söï phaùt trieån reå laø cöïc ñaïi ôû noàng ñoä
0,75 mg/ml.
Hình 1.4.2a: AÛnh höôûng cuûa hoãn hôïp Oligomanuronate (Oligo-M) chöa
baûo hoaø vaø hoãn hôïp Oligoguluronate (Oligo-G) chöa baûo hoaø leân söï daøi ra
cuûa reå caây caø roát (a) vaø caây luùa (b).
Ñoä daøi cuûa reå (cm)
Thôøi gian (ngaøy)
Ñoä daøi cuûa reå (cm)
Thôøi gian (ngaøy)
Ñoä daøi cuûa reå (cm) 22
Haït gioáng cuûa hai loaïi caây naøy ñöôïc ñaët trong moâi tröôøng agar ôû 25 0 C,
trong boùng toái. Khi chieàu daøi cuûa reå ñaït töø 1 – 1,5cm sau 5 – 6 ngaøy thì tieán
haønh caét reå vaø ñem uû trong moâi tröôøng coù chöùa hoån hôïp oligo-G vaø oligo-M ôû
noàng ñoä 0,5mg/ml. Reå ñöôïc uû trong boùng toái vaø xaùc ñònh chieàu daøi sau 4 – 5
ngaøy uû.[13]
Hai nhaø nghieân cöùu Iwasaki vaø Matsubara, Vieän Nghieân cöùu Thöïc
phaåm thuoäc Quaän Kagawa, Takamatsu, Nhaät Baûn ñaõ nghieân cöùu vieäc tinh cheá
caùc oligosacharide alginate với khaû naêng kích thích phaùt trieån reå cuûa caây rau
dieáp. Keát quaû cho thaáy, natri alginate ñöôïc thuyû phaân bôûi alginate lyase töø
Corynebacterium sp., vaø sau ñoù tinh cheá saûn phaåm nhôø quaù trình sieâu loïc
(UF). Khi xöû lyù dung dòch oligo natri alginate baèng phöông phaùp sieâu loïc döôùi
aùp suaát 0,15 Mpa, toác ñoä cuûa doøng chaûy khoaûng 0,6m/s, haàu heát caùc alginate
khoâng ñöôïc phaân caét ñöôïc loaïi boû hoaøn toaøn. Phaàn alginate ñöôïc giöõ laïi laø
moät hoãn hôïp cuûa disacharide tôùi octosacharide vaø coù khaû naêng kích thích söï
phaùt trieån chieàu daøi reå caây rau dieáp ( khoaûng 2 laàn so vôùi maãu ñoái chöùng) ôû
Ñoä daøi cuûa reå (cm)
Noàng ñoä (mg/ml)
Hình 1.4.2b: AÛnh höôûng cuûa noàng ñoä
hoãn hôïp oligo-G ñeán söï daøi ra cuûa reå caây
caøroát (□) vaø luùa (■). Ñoä daøi cuûa reå xaùc
ñònh sau 8 vaø 14 ngaøy.
Hình 1.4.2c: AÛnh höôûng cuûa möùc ñoä
ñoàng truøng hôïp oligo-G ñeán söï daøi ra
cuûa reå caây caøroát (□) vaø luùa (■). Ñoä
daøi cuûa reå xaùc ñònh sau 8 vaø 15
ngaøy. (noàng ñoä 0,75mg/ml)
Ñoä daøi cuûa reå (cm) 23
noàng ñoä trong khoaûng 200 – 300 µg/ml. Möùc ñoä aûnh höôûng khaùc nhau cuûa caùc
oligoalginate ñöôïc xaùc ñònh baèng caùch thöû töøng oligoalginate coù möùc ñoä phaân
caét maïch khaùc nhau. Tri-, tetra-, penta- vaø hexasacharide ñeàu coù khaû naêng
kích thích söï phaùt trieån reå cuûa caây rau dieáp. [14]
1.5. Toång quan sô löôïc veà caùc phöông phaùp nghieân cöùu
1.5.1. Phöông phaùp phaân laäp vi sinh vaät[6],[8]
Phaân laäp vi sinh vaät laø quaù trình taùch rieâng vi sinh vaät ñoù töø maãu vaät
hoaëc quaàn theå vi sinh vaät ban ñaàu ñeå thu gioáng ôû daïng thuaàn khieát.
Caùc vi sinh sinh vaät thuaàn khieát chæ bao goàm caùc teá baøo ñöôïc sinh ra töø teá
baøo ban ñaàu. Haàu heát caùc öùng duïng coâng ngheä sinh hoïc ñeàu lieân quan ñeán
vieäc söû duïng gioáng thuaàn.
Phaàn lôùn caùc phöông phaùp phaân laäp gioáng thuaàn khieát ñeàu döïa treân kyõ
thuaät pha loaõng, thöôøng goàm caùc böôùc sau: chuaån bò maãu, taêng sinh maãu ( neáu
soá löôïng vi sinh vaät coù trong maãu ít ), pha loaõng maãu, caáy maãu leân moâi tröôøng
thaïch ñaëc hieäu, uû maãu ôû ñieàu kieän thích hôïp, kieåm tra vaø phaùt hieän khuaån laïc
ñaë tröng, choïn khuaån laïc ñaëc tröng ñem taïo gioáng thuaàn vaø kieåm tra gioáng
thuaàn.
1.5.2. Phöông phaùp baûo quaûn gioáng vi sinh vaät
Baûo quaûn gioáng vi sinh vaät hay coøn goïi laø giöõ gioáng vi sinh vaät. Baûo
quaûn nhaèm laøm chaäm quaù trình hoâ haáp vaø trao ñoåi chaát cuûa teá baøo vi sinh vaät,
ngaên caûn söï sinh saûn cuûa chuùng, ñoàng thôøi khoâng laøm thay ñoåi phaåm chaát ban
ñaàu cuûa gioáng, coù nghóa laø gioáng ñöôïc baûo quaûn toát thì seõ coù caùc quaù trình
sinh lyù, sinh hoùa gioáng nhö ban ñaàu neáu gaëp ñöôïc ñieàu kieän sinh tröôûng gioáng
nhö ban ñaàu. Gioáng ñem ñi baûo quaûn phaûi ôû traïng thaùi thuaàn khieát vaø trong
traïng thaùi sinh, lyù toát. 24
Coù nhieàu phöông phaùp baûo quaûn gioáng vi sinh vaät, nhö phöông caáy
chuyeàn ñònh kyø leân moâi tröôøng môùi , phöông phaùp giöõ gioáng treân moâi tröôøng
thaïch coù phuû lôùp daàu khoaùng, phöông phaùp giöõ gioáng treân caùt hay haït, hay
phöông phaùp ñoâng khoâ.
1.5.3. Phöông phaùp nghieân cöùu hình thaùi vi sinh vaät.[6]
Vi sinh vaät laø nhöõng cô theå soáng voâ cuøng nhoû beù. Phaàn lôùn caùc vi sinh
vaät khoâng theå quan saùt baèng maét thöôøng maø phaûi nhôø ñeán ñoä phoùng ñaïi cuûa
kính hieån vi. Chính vì theá, kính hieån vi laø moät duïng cuï voâ cuøng quan troïng,
khoâng theå thieáu trong vieäc nghieân cöùu ñaëc tính hình thaùi cuûa vi sinh vaät cuõng
nhö hình daùng, kích thöôùc, khaû naêng di ñoäng, söï hình thaønh baøo töû, sinh saûn .
Caùc tieâu baûn taïm thôøi ñöôïc söû duïng ñeå quan saùt hình thaùi vi sinh vaät
Ñoái vôùi tieâu baûn taïm thôøi coù nhuoäm maøu, thuoác nhuoäm vi sinh vaät phaûi
khoâng ñoäc hoaëc ít ñoäc ñoái vôùi vi sinh vaät caàn quan saùt vaø phaûi pha loaõng ñeán
noàng ñoä nhaát ñònh ñeå ñaûm baûo vi sinh vaät vaãn coøn soáng vaø di ñoäng.
Teá baøo soáng vaø teá baøo cheát coù theå phaân bieät khi nhuoäm maøu vôùi xanh
methylene. Methylene coù maøu xanh khi khoâng coù söï hieän dieän cuûa hydro vaø
khoâng coù maøu khi coù maët cuûa hydro. Khi caùc teá baøo ôû traïng thaùi nghæ ( traïng
thaùi ôû pha oån ñònh treân ñöôøng cong sinh tröôûng ), maëc duø coøn soáng nhöng
khoâng coù khaû naêng khöû maøu xanh cuûa methylene thaønh khoâng maøu. Do ñoù,
neân quan saùt teá baøo ôû giai ñoaïn ñaàu cuûa pha taêng tröôûng.
Cuõng coù theå nghieân cöùu hình thaùi vi sinh vaät baèng phöông phaùp nhuoäm
cuûa Christian Gram. Nhuoäm Gram khoâng nhöõng giuùp phaân bieät vi khuaån nhôø
caùc ñaëc ñieåm cuûa hình thaùi vaø söï saép xeáp cuûa teá baøo maø coøn cung caáp thoâng
tin veà lôùp voû teá baøo. Khi nhuoäm theo phöông phaùp naøy teá baøo vi khuaån Gram
döông coù lôùp voû teá baøo taïo bôûi peptidolycan seõ coù maøu tím coøn vi khuaån Gram