Tài liệu Nghiên cứu tác dụng chống oxyhoá của cao quả nhàu trên thỏ bị chiếu xạ và trên 2 mô hình gây tổn thư

Đề tài: Nghiên cứu tác dụng chống oxyhoá của cao quả nhàu trên thỏ bị chiếu xạ và trên 2 mô hình gây tổn thương gan bằng carbon tetraclorid và paracetamol ở chuột nhắt trắng.

Đặt vấn đề

Miễn dịch học là một lĩnh vực ngày càng phát triển và có nhiều ứng dụng rộng răi trong y, sinh học. Một trong các hướng nghiên cứu quan trọng của miễn dịch là t́m hiểu các yếu tố trong mạng lưới điều hoà, kiểm soát hoạt động của hệ thống này. Trong quá tŕnh hoạt động của hệ thống miễn dịch, có sự tham gia của nhiều chất đóng vai tṛ truyền đạt thông tin giữa các tế bào. Các chất này có tác dụng kích thích hay ḱm hăm sự trưởng thành và các hoạt động chức năng của các tế bào miễn dịch. Những chất được gọi là chất kích thích miễn dịch khi làm tăng cường đáp ứng miễn dịch hoặc ngược lại nếu có tác dụng gây suy giảm đáp ứng miễn dịch được gọi là chất ức chế miễn dịch [3] [8] [9]. Trên lâm sàng các t́nh trạng bệnh lư liên quan đến suy giảm miễn dịch, đặc biệt là suy giảm miễn dịch thứ phát rất phổ biến do nhiễm trùng cấp, mạn tính, nhiễm độc hoá chất, sau trị liệu ung thư bằng tia xạ, AIDS Điều trị các bệnh lư đó ngoài việc điều trị nguyên nhân cần dùng thêm biện pháp kích thích miễn dịch thích hợp. Các chất kích thích miễn dịch có nguồn gốc rất khác nhau, quan trọng nhất phải kể đến các chất kích thích miễn dịch nội sinh (đây là các sản phẩm chế tiết của các tế bào miễn dịch) như: interleukin (IL) 1, 2, 3 .35, interferon (IFN) . gọi chung là các cytokin [53]. Các chất kích thích miễn dịch có nguồn gốc từ vi khuẩn, virus, kư sinh trùng, nấm . nh­ BCG, bronchovaxom, lentinan .[3], [9], [29], [62], [90].
Các chất kích thích miễn dịch có nguồn gốc hoá học được tổng hợp hoặc bán tổng hợp đă được sử dụng nh­ levamisol, imuthiol. Hiệu quả mang lại do việc sử dụng các chất kích thích miễn dịch là rất khả quan, tuy nhiên vẫn c̣n nhiều tồn tại . như chi phí cho một đợt điều trị quá cao khi sử dụng các thuốc kích thích miễn dịch có nguồn gốc nội sinh, không phù hợp với điều kiện kinh tế của phần lớn người bệnh. Trong khi đó các thuốc có nguồn gốc hoá học lại có độc tính cao, ảnh hưởng xấu tới chức năng gan, thận. V́ vậy, việc t́m kiếm và đưa vào sử dụng những chất kích thích miễn dịch có nguồn gốc từ thực vật, đặc biệt là các dược liệu có sẵn trong nước là một vấn đề cấp thiết được đặt ra. Cây nhàu (Morinda citrifolia L. Rubiaceae), mét trong những dược liệu được nhân dân sử dụng lâu đời với mục đích nâng cao sức đề kháng của cơ thể [5], [28]. Đặc biệt gần đây nhiều nhà khoa học trên thế giới đă nghiên cứu sâu hơn về quả của cây nhàu trồng ở Hawaii và đưa ra nhiều kết quả nghiên cứu khả quan về tác dụng chống ung thư, chống oxyhóa và kích thích miễn dịch [46], [75], [81], [97].[98], [99], [100], [101], [102], [116], [175], [218].
Trong các nghiên cứu trước của chúng tôi đă chứng minh cao quả nhàu có tác dụng kích thích miễn dịch thông qua tác dụng kích thích hồi phục các chỉ số miễn dịch ở súc vật thực nghiệm bị suy giảm miễn dịch do chiếu tia gamma và tiêm cyclophosphamid [2]. V́ vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài này nhằm nghiên cứu tác dụng chống oxyhóa và đánh giá sâu hơn về tác dụng kích thích miễn dịch trên thực nghiệm của cao quả nhàu Việt Nam.
Mục tiêu của đề tài:
1. Nghiên cứu tác dụng kích thích miễn dịch in vitro và in vivo của cao quả nhàu trên chuột nhắt trắng.
2. Nghiên cứu tác dụng chống oxyhoá của cao quả nhàu trên thỏ bị chiếu xạ và trên 2 mô h́nh gây tổn thương gan bằng carbon tetraclorid và paracetamol ở chuột nhắt trắng.


Chương 1
Tổng quan tài liệu
1.1. suy giảm miễn dịch trên lâm sàng
1.1.1 Khái niệm suy giảm miễn dịch
Suy giảm miễn dịch là trạng thái hoạt động của hệ miễn dịch không đủ mạnh để chống lại kháng nguyên nhằm bảo vệ cơ thể. Hậu quả của suy giảm miễn dịch là dÔ mắc các bệnh nhiễm khuẩn, tái nhiễm nhiều lần cùng một loại tác nhân gây bệnh, mắc các bệnh mạn tính . Suy giảm miễn dịch được chia làm 2 nhóm: bẩm sinh và mắc phải. Suy giảm miễn dịch bẩm sinh là hậu quả của một hoặc nhiều khiếm khuyết trong quá tŕnh phát triển bào thai. Suy giảm miễn dịch bẩm sinh thường rất khó điều trị, biểu hiện lâm sàng nặng nề và tỷ lệ tử vong cao [63], [64], [77]. Suy giảm miễn dịch mắc phải không bắt nguồn từ các khiếm khuyết do di truyền mà thường do các yếu tố từ môi trường sống gây ra. Điều trị các suy giảm miễn dịch mắc phải bên cạnh việc điều trị nguyên nhân thường dùng thêm các thuốc hỗ trợ điều biến miễn dịch, các chất chống oxy hoá[16], [68], [150], [170], [176], [189], [192], [203].
1.1.2 Suy giảm miễn dịch mắc phải:
Đây là loại bệnh lư rất thường gặp ở cả các nước đang phát triển và phát triển [92]. Dựa vào nguyên nhân gây ra t́nh trạng suy giảm miễn dịch người ta chia ra một số nhóm chính sau:
- Suy giảm miễn dịch do suy dinh dưỡng.
- Suy giảm miễn dịch do nhiễm vi sinh vật: nhiễm vi khuẩn, nấm, kƯ sinh trùng, virus. Đặc biệt suy giảm miễn dịch do nhiễm HIV/AIDS.
- Suy giảm miễn dịch do bệnh lư: các bệnh mạn tính kéo dài, đặc biệt là bệnh ung thư.
- Suy giảm miễn dịch do phóng xạ.
- Suy giảm miễn dịch do thuốc hoặc hóa chất.
- Suy giảm miễn dịch khác như: tuổi già, chấn thương [173]
* Suy giảm miễn dịch trong nhiễm HIV/AIDS
Nhiễm HIV/AIDS là bệnh thời sự của thế kỷ và trên toàn thế giới. Bệnh AIDS do retrovirus HIV-1 hay HIV-2 gây ra. HIV có ái lực cao với phân tử CD4 và đồng thụ thể (Co - receptor) như CXCR4 có trên các tế bào có thẩm quyền miễn dịch chủ yếu là tế bào T[SUB]CD4+ [/SUB] và đại thực bào. Thời kỳ ủ bệnh thường không có triệu chứng. Diễn biến lâm sàng của quá tŕnh nhiễm HIV phản ánh sự tương tác phức tạp giữa tác động của virus trên chức năng của tế bào có thẩm quyền miễn dịch và trên đáp ứng miễn dich của vật chủ. Suy giảm miễn dịch mắc phải do nhiễm HIV/AIDS là t́nh trạng nhiễm khuẩn kéo dài, trường diễn dai dẳng, diễn biến chậm nhưng hậu quả rất nặng nề dẫn đến cơ thể bị suy giảm miễn dịch đặc biệt là suy giảm miễn dịch qua trung gian tế bào. Virus tấn công vào các tế bào T[SUB]CD4[/SUB], chemokin (CCR-5, CXCR-4) do các tế bào này có thụ thể với virus. Người nhiễm HIV bị mất lympho T[SUB]CD4. [/SUB]Do thiếu hụt T[SUB]CD4[/SUB] dẫn đến các tổn thương miễn dịch kèm theo v́ T[SUB]CD4[/SUB] có vai tṛ rất to lớn trong đáp ứng miễn dịch cả dịch thể và qua trung gian tế bào [8], [9], [77], [169].
* Suy giảm miễn dịch trong ung thư
Ung thư là một bệnh ngày càng phổ biến và gia tăng trên toàn thế giới. Về mặt tế bào học th́ các tế bào ung thư bắt nguồn từ các tế bào b́nh thường của cơ thể nhưng v́ một nguyên nhân nào đó các tế bào này bị đột biến và phát triển vô hạn định làm cơ thể không thể kiểm soát được nữa. Về mặt gen học, sự đột biến trong quá tŕnh phân bào là hiện tượng b́nh thường, chúng luôn bị loại trừ theo cơ chế miễn dịch. Như vậy khi bị mắc ung có thể do hệ miễn dịch của cơ thể đă bị suy giảm hoặc bản thân bệnh ung thư làm hệ miễn dịch bị suy yếu hơn, đặc biệt suy giảm miễn dịch qua trung gian tế bào do các tế bào lympho T đảm nhận [3], [9], [79].
Điều trị miễn dịch có nhiều hướng nhưng vẫn đang c̣n trong thời kỳ thử nghiệm. Các kháng thể đơn ḍng đặc hiệu th́ vẫn thuộc loại khác loài nên biến chứng do gây mẫn cảm dị loài c̣n nghiêm trọng hơn là tác dụng diệt tế bào ung thư. Nhiều trường hợp sử dụng các cytokin kết quả th́ chưa rơ nhưng phản ứng toàn thân rất mạnh mẽ nhiều khi phải bỏ thuốc. INF-α đă được dùng trong popilloma, leukose, IL-2 trong adenocarcinoma và melanoma đă tạo được những thời kỳ thoái lui kéo dài của bệnh. Rosenberg lần đầu tiên dùng IL-2 trên ex-vivo nghĩa là ủ tế bào lympho của bệnh nhân với cytokin này ngoài cơ thể để tạo ra LAK, sau đó tiêm trả lại cho bệnh nhân th́ ung thư thu nhỏ lại [3], [8], [9], [73], [205]. Trong u lympho một phương pháp điều trị có nhiều hứa hẹn là tự ghép tế bào tuỷ xương và tế bào máu cuống rốn. Chọn lúc bệnh thoái lui tự nhiên, lấy tuỷ xương cất trong đông lạnh sâu, sau đó dùng tia xạ với liều gây chết tế bào (các tế bào ung thư ngoại vi sẽ bị tiêu diệt hết), khi Êy truyền lại lượng tế bào gốc dự trữ cho bệnh nhân. Hoặc dùng tế bào máu cuống rốn truyền cho bệnh nhân. Các tế bào này có thể giúp cơ thể hồi phục hoàn toàn nhất là nếu chúng được sử lư trước để chỉ có tế bào gốc mới được truyền vào.
Một hướng mới đang được chú ư là tác dụng ngay vào vị trí mà quá tŕnh phát triển tế bào bị phong bế nhằm phục hồi lại quá tŕnh biệt hóa tế bào. Đó là dùng các chất chống oxyhóa tại chỗ hoặc toàn thân, hoặc dùng thực phẩm chức năng như các chất chống oxyhoá [29], [61],[63],[78], [196].

1.2. Các tác nhân gây suy giảm miễn dịch thực nghiệm:
Các tác nhân gây suy giảm miễn dịch thực nghiệm được chia thành nhiều nhóm khác nhau: Thuốc hoặc hóa chất, yƠu tố vật lư: phóng xạ, bức xạ ion, gây ung thư thực nghiệm, gây nhiễm các vi sinh vật: vi khuẩn, nấm, virus .
1.2.1.Thuốc hoặc hóa chất:
Hoá chất thường được sử dụng là cyclophosphamid (CY), cyclosporinA, dexamethason, azathioprin . Mỗi một chất có một hiệu lực và một cơ chế gây suy giảm miễn dịch riêng.
* Nhóm kháng purin:
Ba chất thường dùng nhất là 6-mercaptopurin, azathioprin và thioguanin. Azathioprin (Imuran) là dẫn xuất nitro-imidazol của mercaptopurin là chất hay được sử dụng.
- Tác dụng và cơ chế: Tác dụng ức chế miễn dịch: nồng độ thấp 10[SUP]-2[/SUP] mg/l, azathioprin ức chế sinh sản các lympho T, gây độc tế bào và ức chế các tế bào tạo kháng thể. Với nồng độ thấp hơn 1mg/l, azathioprin ức chế phản ứng tạo hoa hồng tự nhiên của chuột cống. Trên người, với liều ức chế miễn dịch thông thường không làm giảm bạch cầu, tác dụng này chỉ xuất hiện ở liều cao gây độc. Azathioprin tác dụng lên cả miễn dịch đặc hiệu và không đặc hiệu, kéo dài thời gian tồn tại của mảnh ghép. Tác dụng lên sản xuất kháng thể có đặc điểm: dùng đồng thời hoặc 48 giê sau khi dùng kháng nguyên mới có tác dụng, c̣n nếu dùng trước th́ không có tác dụng. Tác dụng lên sản xuất IgG hơn là IgM, tác dụng lên đáp ứng miễn dịch nguyên phát hơn là thứ phát. Phối hợp azathioprin với kháng nguyên liều cao có thể tạo ra t́nh trạng dung nạp miễn dịch đặc hiệu. Trên chuột nhắt trắng dùng liều 20-35 mg và chuột cống liều 15-20 mg/kg thể trọng để gây suy giảm miễn dịch thực nghiệm [6], [88], [205] * Nhóm mù tạc nitơ (nitrogen mustard)
Hai thuốc thường dùng là cyclophosphamid (CY) và clorambuci
-Cơ chế tác dụng ức chế miễn dịch: Liều cao CY: 100-300mg/kg thể trọng trên chuột cống trắng thấy giảm tế bào lympho, teo hạch lympho, teo vùng vỏ tuyến ức, teo lách. Các tổn thương này phục hồi nhanh, sau ngừng thuốc vài ngày thấy tăng sinh ở các cơ quan lympho và đáp ứng miễn dịch trở lại b́nh thường sau 1 - 2 tuần. Cyclophosphamid tác dụng mạnh trên lympho B hơn là lympho T. Điều này có thể là do thời gian sống của lympho B ngắn hơn lympho T.
Trên đáp ứng miễn dịch dịch thể: cyclophosphamid tác dụng chủ yếu lên IgG và tác dụng yếu hơn với IgM, tác dụng lên phản ứng miễn dịch nguyên phát mạnh hơn thứ phát. Làm mất phản ứng mẫn cảm chậm. Cyclophosphamid thường dùng liều 100 - 200 mg/kg trên chuột nhắt, liều 150mg/kg trên chuột cống để gây suy giảm miễn dịch thực nghiệm [6], [20], [32].
* Methotrexat: chế cả miễn dịch tế bào và miễn dịch dịch thể, thông qua ức chế sự nhân lên và giảm chức năng của tế bào lympho B và T. Tuy nhiên thuốc Ưt được dùng trên thực nghiệm [3], [6].
* Cyclosporin A: Cycloporin có cấu trúc một pepid ṿng được chiết xuất từ nấm Tolypoclodium inflatum gams. Thuốc ức chế chọn lọc với lympho T. Với nồng độ điều trị, cyclosporin không gây ức chế tủy xương. Liều điều trị thuốc ức chế sản sinh và ức chế sự giải phóng các lymphokin, đặc biệt là interleukin 2 làm cho lympho T không trở thành tế bào lympho T nhận cảm được. Liều cao, thuốc ức chế interleukin 2-receptor [3], [11], [73], [205].

H́nh 1.1: Cơ chế tác dụng suy giảm miễn dịch của cycloporin A
* Corticoid: với liều 2-10mg, ở chuột cống corticoid hủy tế bào lympho, đặc biệt là huỷ tế bào tuyến ức. Tác dụng làm giảm tế bào lympho sớm xuất hiện, đồng thời làm giảm khả năng tập trung tế bào lympho, tế bào đơn nhân và bạch cầu đa nhân ở vị trí viêm. Corticoid ức chế phản ứng quá mẫn chậm, ức chế di tản đại thực bào, làm giảm lympho độc với tế bào, kéo dài thời gian tồn tại của mảnh ghép da. Hiệp đồng với azathioprin trong ghép cơ quan, làm giảm khả năng lưu giữ kháng nguyên trên bề mặt đại thực bào, và có thể làm giảm tính thực bào của nó thông qua sự giảm giải phóng interleukin 1. Corticoid làm giảm sự sản xuất IL-2, IFN g, làm tăng sự dị hóa của IgG. Liều lượng: trên chuột nhắt dùng liều 20-40 mg/kg thể trọng để gây suy giảm miễn dịch thực nghiệm [6], [9], [205].

H́nh1.2 Cơ chế tác dụng suy giảm miễn dịch của corticoid
* Kháng thể kháng lympho
Có thể dùng các kháng thể đa clôn hay các kháng thể đơn clôn chống các phân tử có mặt trên các tế bào lympho nh­ CD1, 2, 3, 4 . tùy theo mục đích gây suy giảm đáp ứng miễn dịch tế bào hay dịch thể mà có thể dùng các kháng thể kháng CD đặc trưng, ví dụ: dùng kháng CD2, CD3 để ức chế miễn dịch tế bào (ức chế các tế bào T), kháng CD40 để ức chế miễn dịch dịch thể (ức chế các tế bào B) [3], [73], [205].
+ Kháng thể đa ḍng:Được tạo ra bằng cách gây miễn dịch cho súc vật bằng tế bào lympho người. Nếu kháng nguyên là lympho lấy từ tuyến ức sẽ tạo ra kháng thể kháng tế bào T (antithymocyteserum- ATS). Khi kháng nguyên lympho có nguồn gốc từ lách, máu ngoại vi sẽ tạo ra thể kháng lympho B.
Cơ chế tác dụng: Lympho T có đời sống kéo dài nên bị phá hủy ở gan, huyết thanh kháng lympho bào cũng loại trừ các lympho này. Tác dụng nổi bật của kháng thể đa ḍng là lên miễn dịch tế bào, đặc biệt là phản ứng quá mẫn chậm, phản ứng loại trừ mảnh ghép, phản ứng mảnh ghép chống vật chủ. Kháng thể đa ḍng c̣n làm trở ngại sự nhận biết kháng nguyên trên receptor của tế bào lympho [3], [73], [205].
+ Kháng thể đơn ḍng :Những kháng thể được tạo ra bởi sự gây mẫn cảm bằng các kháng nguyên đặc hiệu ở màng tế bào lympho T và B nên có ưu điểm hơn kháng thể đa ḍng, v́ :
- Thuốc có phản ứng chọn lọc với kháng nguyên bề mặt chỉ có trên một loại tế bào miễn dịch, rất đặc trưng. Ví dụ: CD-3 có mặt trong hầu hết các tế bào T chín, CD-4 có mặt trên tế bào T[SUB]h[/SUB] trong khi CD-8 lại có mặt trờn cỏc tế bào T[SUB]c.[/SUB]
- Không có phản ứng chéo với các tế bào không phải lympho như tiểu cầu.
- Kháng thể có thể định lượng được nên việc sử dụng được chính xác hơn. Kháng thể muromonab CD[SUB]3[/SUB] (biệt dược Orthoclone OKT3) là loại kháng thể thuộc nhóm IgG-2a có trọng lượng phân tử 150.000 daltons. Thuốc tác dụng thông qua sự giảm chức năng và sự sản xuất các cytokin của lympho T [88], [205].

* Kháng các cytokin và receptor của chúng:
Đây là nhóm thuốc mới, rất đặc hiệu. Khi dùng trên lâm sàng Ưt tác dụng không mong muốn hơn các nhóm thuốc ức chế miễn dịch khác. Dùng trên thực nghiệm để gây suy giảm miễn dịch trên súc vật giúp t́m hiểu cơ chế tác dụng của thuốc thử khu trú hơn. Phần lớn các thuốc trong nhóm này được sản xuất theo công nghệ tái tổ hợp gen [3], [88], [205].
- Thuốc kháng interleukin -2 receptor (kháng CD25)
Cơ chế tác dụng: IL-2 là một cytonkin quan trong bậc nhất trong quá tŕnh biệt hóa và trưởng thành của các tế bào lympho T. Đồng thời IL-2 là sản phẩm tiết của tế bào T[SUB]h[/SUB] khi được hoạt hóa. Khi IL-2 gắn được vào receptor (có mặt trên các tế bào T chín) nó sẽ khởi động một ḍng thác miễn dịch, phản ứng viêm và sự biệt hóa trưởng thành các tế bào T diễn ra nhanh chóng. Hơn nữa sự kết hợp IL-2 và recptor c̣n ảnh hưởng đến cả đáp ứng miễn dịch dịch thể. Thuốc kháng interleukin -2 receptor sẽ ức chế đáp ứng miễn dịch tế bào rất điển h́nh [88], [123].
- Thuốc kháng TNF[SUB]α[/SUB] (Remicade).
Cơ chế tác dụng: TNF[SUB]α[/SUB] là một cytokin được các tế bào có thẩm quyền miễn dịch tiết ra khi tiếp xúc với kháng nguyên, đặc biệt là tế bào ung thư, virus, kư sinh trùng. TNF[SUB]α[/SUB] có vai tṛ quan trọng trong miễn dịch chống ung thư và chống vi sinh vật. Thuốc kháng TNF[SUB]α[/SUB] có ái lực cao với với TNF[SUB]α[/SUB] nên ngăn chặn được TNF[SUB]α [/SUB]kết hợp với receptor của nó và làm mất các tác dụng của TNF[SUB]α[/SUB] [88], [123], [205].
- Thuốc ức chế LFA-1 (Enlimomab) hay kháng CD-11a.
Thuốc ức chế LFA-1 kết hợp với LFA-1và ngăn chặn LFA-1 ICAM (phân tử kết dính ngoại tế bào). Thuốc đang dùng trong giai đoạn thử nghiệm để làm giảm thải trừ mảnh ghép tối cấp trong ghép tạng [88], [205].

1.2.2. Tác nhân phóng xạ gây suy giảm miễn dịch thực nghiệm:
Tia xạ tác động lên các cơ quan của cơ thể thông qua năng lượng bức xạ gây biến đổi cấu trúc các phân tử sinh học, phân hủy chúng và tạo ra các ion, gốc tự do trong các tế bào và các mô. Các gốc tự do tiếp tục phản ứng chuỗi tạo thành gốc tự do thứ cấp tiếp tục tấn công vào các phân tử sinh học khác. Khi các phân tử sinh học bị tổn thương dẫn đến rối loạn trao đổi chất trong tế bào. Hậu quả là tế bào bị biến đổi về cấu trúc, chức năng và có thể chết [19]. Tác dụng của bức xạ ion hoá đồng thời lên nhiều cơ quan trong cơ thể, nhưng tổn thương cấp tính trước tiên xảy ra ở các tế bào hệ lympho và các tế bào máu tại tủy xương. Do vậy máu và cơ quan tạo máu là tổ chức đầu tiên của cơ thể chịu sự tác động của phóng xạ [1], [10], [43], [47], [56].
Nh­ vậy, với cơ chế của tác dụng bức xạ ion, các tế bào và cơ quan của hệ miễn dịch bị tổn thương không chọn lọc, nghĩa là cả hai h́nh thức miễn dịch tự nhiên và đặc hiệu đều bị tổn thương. Phóng xạ dùng trong y học để gây suy giảm miễn dịch gồm nhiều loại tia như tia a, b, g và tia X. Mọi bức xạ ion hoá dù ở dạng sóng hay dạng hạt đều có giá trị năng lượng nhất định. Khi gặp vật chất, năng lượng sẽ truyền cho nguyên tử hoặc phân tử của vật chất. Trong số các tia xạ trên tia g và tia X hay được dùng để gây suy giảm miễn dịch.
-Tia g (gamma): Là bức xạ điện từ có khả năng đâm xuyên cao nhất. ở các loài khác nhau, mức độ nhạy cảm với những bức xạ cũng khác nhau. Ví dụ LD 50/30 (là liều bức xạ gây tử vong 50% số cá thể trong ṿng 30 ngày kể từ khi bị chiếu xạ), thay đổinh­ sau: Chuột lang: 300-500 rad, chuột cống: 450-600 rad, thá: 900-1000 rad [10], [56]. Có thể chiếu tia g toàn thân hay các tổ chức lympho. Đây là biện pháp gây tổn thương hệ thống miễn dịch không chọn lọc. Liều chiếu và cách thức tiến hành tuỳ thuộc vào súc vật thử nghiệm, vào mục tiêu của nghiên cứu [18], [15], [22]. Theo Phan Thị Phi Phi: có thể gây suy giảm miễn dịch cấp bằng liều 600 rad cho chuột nhắt một lần duy nhất hoặc có thể gây suy giảm mạn tính bằng liều 100 rad cho mỗi chuột trong mét ngày, kéo dài 6-7 ngày [20], [31], [32].
- Tia X: cũng là tia bức xạ điện từ, khả năng đâm xuyên kém hơn tia g. Tia X được sử dụng nhiều nhất trong chụp h́nh y học, Ưt được dùng để gây suy giảm miễn dịch trên súc vật thực nghiệm [31].
1.2.3. Các phương pháp khác: Gây ung thư thực nghiệm gây nhiễm vi sinh vật . Người ta đă gây được ung thư thực nghiệm bằng các tác nhân khác nhau trên nhiều loài súc vật như dùng yếu tố vật lư, hóa học, sinh học. Trong đó hay dùng nhất là hóa chất và virus [3]. Từ năm 1911 Peyton Rous đă gây được ung thư cho gà bằng tác nhân virus. Ngay sau đó vào năm 1915 Yamagiwa và cộng sự lần đầu tiên dùng hắc Ưn gây được ung thư trên tai thá. Sau này việc gây ung thư thực nghiệm trở nên dễ dàng hơn nhờ ghép các khối u thực nghiệm hoặc tiêm các tế bào ung thư đặc chủng vào các loài súc vật. Các phương pháp gây ung thư thực nghiệm khác nhau tạo ra các đáp ứng miễn dịch khác nhau, từ đó sơ bộ t́m ra được cơ chế chống ung thư của chất mới đang được nghiên cứu. Ví dụ khi khối ung thư thực nghiệm gây ra bằng hóa chất th́ kháng nguyên đặc hiệu ung thư thay đổi tùy vào tổ chức bị ung thư hóa. Nếu tác nhân là virus th́ không có kháng nguyên đặc hiệu của tổ chức bị ung thư hóa [3], [9], [205].
- Các tác nhân vật lư gây ung thư thực nghiệm:
· Bức xạ tử ngoại: gây ung thư da. Chiếu tia tử ngoại có bước sóng từ 600-3400 Angtron để gây ung thư da trên chuột nhắt trắng [3].
· Bức xạ ion hóa: dùng tia X, tia gamma gây ung thư trên nhiều loài súc vật. Gây ung thư máu trên chuột nhắt bằng chiếu xạ toàn thân trong thời gian dài khoảng 90 ngày. Gây ung thư buồng trứng trên chuột nhắt ở liều 25-50 rad [3].
+ Các tác nhân sinh học gây ung thư thực nghiệm:
Đặc biệt do virus oncogen v́ khi tích hợp vào ADN của vật chủ chúng thường gây biến chuyển ác tính tế bào. Một số các virus gây ung thư thực nghiệm hay được sử dụng nh­ Murine sacoma virus, Murine leukemia virus, herpes virus Hiện nay hay sử dụng nhất là cấy ghép tổ chức ung thư hoặc tiêm các tế bào ung thư [3], [205].

1.3. Một số xét nghiệm thường được sử dụng để đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch:
1.3.1. Nghiên cứu đánh giá sự giải phóng các cytokin: IL-1alpha, IL-1 beta, IL-6, IL-8 và TNF-alpha từ bạch cầu người [83].
- Nguyên lư: các cytokin là sản phẩm của tế bào khi chóng được hoạt hoá, là các peptid có hoạt tính sinh học cao, được kích thích sinh tổng hợp nh­ những chất nội tiết. Các cytokin liên quan đến nhiều quá tŕnh, nhiều loại tế bào khác nhau. Ví dụ: quá tŕnh viêm, quá tŕnh đáp ứng miễn dịch và nhiều quá tŕnh khác. Hoạt tính sinh học của các cytokin này rất đa dạng, ảnh hưởng đến nhiều loại tế bào như: các cytokin của các tế bào lympho T, hoạt tính của các lympho bào B và các yếu tố khác nhau như chất gây sốt, yếu tố hủy cốt bào, yếu tố biệt hóa tuyến ức, yếu tố do đại thực bào (IL-1). Yếu tố kích thích tế bào gan, yếu tố phát triển tế bào lai, yếu tố kích thích tế bào mới (IL-6). Yếu tố hóa ứng động bạch cầu, ức chế sự kết dính của bạch cầu (IL-8). Yếu tố hoại tử khối u (TNF) [83].
- Tiến hành: lấy máu ngoại vi của người trưởng thành khỏe mạnh, khoảng 10 ml, phá bỏ hồng cầu, tiểu cầu. Ly tâm, tách lấy các bạch cầu, nuôi cấy và ủ với kháng nguyên đặc hiệu (PHA làm kháng nguyên). Sau thời gian nuôi cấy, lấy chất tiết của các tế bào này định lượng các cytokin bằng phương pháp ELISA [83].
1.3.2. Nghiên cứu chất đối kháng với yếu tố hoại tử khối u (TNF-alpha antagonism)
- Nguyên lư: có 2 phân nhóm của TNF (TNF alpha cachetin và TNF beta lymphotoxin). Một số tác dụng của TNF đă được nghiên cứu như: cảm ứng IL-1, điều ḥa hoạt tính các tế bào nội mô mạch máu và tăng cường chức năng miễn dịch đặc hiệu như diệt các tế bào ung thư, tế bào nhiễm virus Tuy nhiên không phải khi nào tác dụng của TNF cũng có lợi cho người bệnh, TNF alpha nếu được giải phóng ra quá nhanh và nhiều có thể gây tử vong do suy tuần hoàn, rối loại chuyển hóa V́ vậy, trong một số trường hợp thuốc có tác dụng đối kháng với TNF alpha có tác dụng làm hạn chế tỷ lệ tử vong trên lâm sàng [83].
- Tiến hành:Dùng các tế bào thuộc ḍng L 929 nuôi cấy trong các giếng, mỗi giếng có 2 x 10[SUP]4[/SUP] tế bào, điều kiện nhiệt độ 37[SUP]o[/SUP]C và không khí có 5% CO[SUB]2[/SUB]. Các tế bào nuôi cấy được tiếp xúc với TNFa (cho vào mỗi giếng 1-10UI), ủ Êm và nuôi cấy thêm 20 giê. Sau khi nuôi cấy đủ thời gian, các tế bào c̣n sống được thu hoạch, giữ ở nhiệt độ pḥng trong 30 phút, thêm vào mỗi giếng 100ml LDH, 15 phót sau đo hoạt tính enzym trên máy quang phổ ở bước sóng 490 nm.
- Một số phương pháp cải tiến: Maloff và Delmendo: đánh giá sự kết hợp của TNFa với receptor TNF của người. Dùng tế bào HeLa S3 của người, nuôi cấy và ủ với TNFa có gắn Iod phóng xạ (I[SUP]125[/SUP]) [83].
1.3.3. Nghiên cứu đánh giá sự tăng sinh của các tế bào lympho với các mitogen (Mitogen induced lymphocyte proliferation).
- Nguyên lư: Các tế bào lympho có thể được kích thích tăng quá tŕnh tăng sinh khi được cảm ứng bằng các mitogen khác nhau. Quá tŕnh biệt hóa sẽ thể hiện thông qua tăng sinh tổng hợp DNA. Định lượng DNA bằng phương pháp đánh dấu phóng xạ [SUP]+[/SUP]3H-thymidin, nhờ đó người ta xác định được các nucleotid mới
Trên ex vivo:Các súc vật được dùng thuốc thử mỗi ngày một lần trong 5 ngày liên tục. Sau khi dùng thuốc thử đủ ngày, lấy tổ chức lách, tách lấy tế bào (Hỗn dịch chứa 5x 10[SUP]6[/SUP] tế bào/ml). Các mitogen được đưa vào các giếng nuôi cấy. ủ Êm và nuôi cấy tế bào trong điều kiện chuẩn: nhiệt độ 37[SUP]o[/SUP]C, trong không khí có 5 % khí CO[SUB]2[/SUB], thời gian nuôi cấy 48- 60 giờ. Thêm 0,25mC[SUP]+[/SUP]3H-thymidin vào các giếng nuôi cấy. Thu hoạch các tế bào bằng dụng cụ lọc thủy tinh chuyên biệt, làm khô và định lượng [4], [83].
1.3.4. Nghiên cứu đánh giá sự chuyển dạng của tế bào lympho T (T cell proliferation)
- Nguyên lư: Các tế bào lympho T sẽ tăng biệt hóa khi được kích thích bới kháng nguyên đặc hiệu. Dùng các tác nhân khác nhau làm suy giảm về số lượng và chức năng của các tế bào lympho T, sau đó gián tiếp định lượng các tế bào lylpho T bằng phương pháp đánh dấu phóng xạ ([SUP]+[/SUP]3H-thymidin) và chất tiết đặc hiệu của chúng là IL-2 bằng phương pháp ELISA [83].
- Tiến hành: các tế bào lympho máu ngoại vi gồm cả tế bào B và T. Dùng kháng CD3 (phân tử CD3 là một tổ hợp gồm 4 chuỗi peptid có trọng lượng phân tử từ 20-26 kD, phân tử CD3 có mặt ở mọi tế bào T chín) hoặc kháng CD28 để cô lập các tế bào T. Sau đó ủ và nuôi cấy các tế bào T với kháng nguyên đặc hiệu trong các giếng nuôi cấy tế bào. Thêm vào các giếng 1mC [SUP]+[/SUP]3H-thymidin để gián tiếp định lượng số lượng các tế bào lympho T. Dùng phương pháp ELISA để định lượng interleukin-2 receptor (IL-2R).
- Đánh giá: IL-2 là cytokin quan trọng, được sản xuất bởi các tế bào T[SUB]h[/SUB]. Dưới tác dụng của IL-2 các tế bào lympho T tăng cường phân chia và biệt hóa. IL-2R gồm 2 chuỗi peptid (chuỗi a: trọng lượng phân tử 75 kD và b: 55 kD). Các tế bào T khi nghỉ chỉ có một Ưt chuỗi a, hầu nh­ không c̣n chuỗi a. Những receptor có ái tính cao với IL2 có khả năng cảm ứng sự tăng trưởng và biệt hóa tế bào T. Receptor có ái tính thấp với IL2 chỉ có chuỗi a, chúng không hoạt hóa được tế bào T [3], [83].
1.3.5. Nghiên cứu đánh giá khả năng tạo quàng dung huyết in vitro (Plaque forming colony test in vitro)[4], [39], [83].
1.3.6. Đánh giá khả năng tạo hoa hồng mẫn cảm với kháng nguyên [4], [39].
1.3.7. Phản ứng b́ với kháng nguyên OA [4], [83].
1.3.8. Xác định số lượng các dưới nhóm của lympho bào T [38], [205].
Dùng kỹ thuật miễn dịch h́nh quang xác định sè lượng T[SUB]CD3[/SUB], T[SUB]CD4[/SUB], T[SUB]CD8a, [/SUB]T[SUB]CD8b[/SUB]. Nguyên lư: các tế bào lympho T có nhiều loại như T[SUB]h[/SUB], T[SUB]c[/SUB], T[SUB]s[/SUB], T[SUB]DTH[/SUB] mỗi loại có chức năng đặc hiệu và đặc trưng bởi các dấu Ên miễn dịch riêng (các CD) trên bề mặt tế bào. Ví dụ, CD3: đặc trưng cho các tế bào T9 sau khi đă được hoạt hoá bởi các kháng nguyên đặc hiệu, CD4: đặc trưng cho các tế bào T hỗ trợ, trong khi CD8 đặc trưng cho các tế bào T độc (là những tế bào có chức năng quan trọng trong miễn dịch chống tế bào ung thư và virus)
Đánh giá số lượng các dưới nhóm của lympho bào T bằng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trực tiếp trong máu ngoại vi và trong tổ chức lympho. Xác định tỷ lệ phần trăm tế bào T[SUB]CD3[/SUB], T[SUB]CD4[/SUB], T[SUB]CD8a, [/SUB]T[SUB]CD8b[/SUB] trong tổng số 100 tế bào. Đánh giá: các tế bào T[SUB]CD3[/SUB] là những tế bào T chín sau khi được mẫn cảm với kháng nguyên đặc hiệu. Phân tử CD3 của các tế bào T chín liên kết trực tiếp với TCR. Sè lượng các tế bào T[SUB]CD3[/SUB] tăng tương ứng với khả năng đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào được cải thiện.
Các tế bào T[SUB]CD4 [/SUB]và T[SUB]CD8[/SUB] là các quần thể tế bào gây độc với virus và các tế bào ung thư. Bản thân chúng có thể tiêu diệt trực tiếp các tế bào ung thư và các tế bào nhiễm virus (T[SUB]CD8[/SUB]) hoặc gián tiếp thông qua các cytokin do chúng tiết ra nh­ IL2, TNFa.
1.3.9. Định lượng các cytokine: IL-2, TNFa, INF [38], [83], [205]