Thạc Sĩ Nghiên cứu sự phát sinh hình thái và tăng trưởng của cây hosta (hosta frances williams) trong điều k

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
Chuyên ngành: Sinh lý Thực vật
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
NĂM 2012

MỤC LỤC

MỤC LỤC .i
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iv
DANH MỤC CÁC BẢNG v
DANH MỤC CÁC HÌNH vii
MỞ ĐẦU . 1

1. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. ĐẶC ĐIỂM LOÀI HOSTA . 2
1.1.1. Phân loại học 2
1.1.2. Nguồn gốc và lịch sử phát hiện 2
1.1.3. Hình thái cây . 3
1.1.4. Đặc điểm về sinh thái . 6
1.1.5. Sâu hại và bệnh trên cây Hosta . 7
1.1.6. Nhân giống cây Hosta 8
1.2. GIÁ TRỊ KINH TẾ CỦA HOSTA 9
1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ CÂY HOSTA 11
1.4. CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG THỰC VẬT . 14
1.4.1. Auxin 14
1.4.2. Cytokinin 16
1.4.3. Gibberellin 17
1.4.4. Ethylen 18
1.4.5. Acid abscisic . 19
1.5. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CÁC CHẤT ĐIỀU HÒA SINH
TRƯỞNG THỰC VẬT 20
1.6. KHÁI QUÁT VỀ KỸ THUẬT VI NHÂN GIỐNG . 21
1.6.1. Phương pháp vi nhân giống . 21
1.6.2. Phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào (Thin cell layer culture) 24

1.6.3. Phương pháp vi nhân giống quang tự dưỡng (photoautotrophic micropropagation) 25
1.7. SỰ TÁI SINH CƠ QUAN TRONG NHÂN GIỐNG IN VITRO 26
1.7.1. Sự hình thành chồi bất định . 28

1.7.2. Sự hình thành rễ bất định 29

2. CHƯƠNG II. VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP

2.1. VẬT LIỆU . 31

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu . 31

2.1.2. Môi trường 31

2.1.3. Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu 32

2.2. PHƯƠNG PHÁP 33

2.2.1. Thí nghiệm 1. Sự phát sinh hình thái trong nuôi cấy lớp mỏng tế bào cây

Hosta từ các vật liệu nuôi cấy ban đầu có nguồn gốc mẫu khác nhau . 33

2.2.2. Thí nghiệm 2. Sự phát sinh chồi và rễ của nuôi cấy lớp mỏng gốc thân cây Hosta nuôi cấy in vitro . 35
2.2.3. Thí nghiệm 3. Mối tương quan giữa các chỉ tiêu tăng trưởng và hàm lượng chất ĐHSTTV của chồi cây Hosta hình thành từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào gốc thân 37
2.2.4. Thí nghiệm 4. Ảnh hưởng của thành phần khoáng, vitamin lên sự tăng trưởng của cụm chồi cây Hosta nuôi cấy in vitro 39
2.2.5. Thí nghiệm 5. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy thoáng khí lên quá trình tăng trưởng và tích lũy ethylen trong hộp nuôi cấy của cụm chồi cây Hosta nuôi cấy in vitro 40
2.2.6. Các chỉ tiêu theo dõi thí nghiệm thí nghiệm 4 và thí nghiệm 5 . 41

2.3. PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN VÀ TÍNH SỐ LIỆU 41

2.3.1. Tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo, tạo chồi, tạo rễ (%) . 41

2.3.2. Số chồi/mẫu, số rễ/ mẫu, số lá mở/ mẫu 41

2.3.3. Gia tăng trọng lượng tươi (mg/cây) . 42

2.3.4. Diện tích lá/ mẫu 42







2.3.5. Tỷ lệ mẫu có lá vàng (%) 42

2.3.6. Phương pháp nuôi cấy mẫu . 42

2.3.7. Quan sát hình thái giải phẫu 42

2.3.8. Phương pháp chụp ảnh bằng kính hiển vi điện tử quét SEM 42

2.3.9. Phương pháp xác định các chất ĐHSTTV nội sinh 43

2.3.10. Phương pháp sắc ký khí GC 45

2.4. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH THỐNG KÊ 46

3. CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ & THẢO LUẬN

3.1. KẾT QUẢ . 47

3.1.1. Thí nghiệm 1. Sự phát sinh hình thái trong nuôi cấy lớp mỏng tế bào cây

Hosta in vitro từ các vật liệu nuôi cấy ban đầu có nguồn gốc mẫu khác nhau . 47

3.1 2. Thí nghiệm 2. Sự phát sinh chồi và rễ của nuôi cấy lớp mỏng gốc thân cây Hosta nuôi cấy in vitro . 55
3.1.3. Thí nghiệm 3. Mối tương quan giữa các chỉ tiêu tăng trưởng và hàm lượng chất ĐHSTTV của chồi cây Hosta in vitro hình thành từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào gốc thân . 63
3.1.4. Thí nghiệm 4. Ảnh hưởng của thành phần khoáng và vitamin lên sự tăng trưởng của cụm chồi cây Hosta nuôi cấy in vitro . 70
3.1.5. Thí nghiệm 5. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy thoáng khí lên quá trình tăng trưởng và tích lũy ethylen trong hộp nuôi cấy của cụm chồi cây Hosta nuôi cấy in vitro 78
3.2. THẢO LUẬN . 85

3.2.1. Sự phát sinh hình thái . 85

3.2.2. Sự tăng trưởng 91

4. CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN & ĐỀ NGHỊ

4.1. KẾT LUẬN 98

4.2. ĐỀ NGHỊ 98

TÀI LIỆU THAM KHẢO . 99

PHỤ LỤC I


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1. Bố trí thí nghiệm 1 34

Bảng 2.2. Bố trí thí nghiệm 2 36

Bảng 2.3. Bố trí thí nghiệm 3 38

Bảng 2.4. Bố trí thí nghiệm 4 39

Bảng 2.5. Bố trí thí nghiệm 5 40

Bảng 3.1. Kết quả tỷ lệ hình thành mô sẹo, chồi và rễ của mẫu lớp mỏng cây Hosta in vitro từ các vật liệu nuôi cấy có nguồn gốc ban đầu khác nhau sau 8 tuần nuôi cấy 47
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của phương pháp cắt mẫu lớp mỏng gốc thân lên chỉ tiêu số chồi, số rễ hình thành trên mẫu và trọng lượng tươi của cụm chồi Hosta in vitro sau 8 tuần nuôi cấy 49
Bảng 3.3. Hàm lượng chất ĐHSTTV nội sinh trong các bộ phận khác nhau và toàn bộ cụm chồi cây Hosta in vitro ở ngày đầu tiên của thí nghiệm . 53
Bảng 3.4. Hàm lượng các chất ĐHSTTV nội sinh của mẫu cây Hosta in vitro

được nuôi cấy từ lớp mỏng sau 8 tuần . 53

Bảng 3.5. Kết quả sự hình thành chồi, hình thành rễ và trọng lượng tươi của mẫu lớp mỏng cắt dọc cây Hosta dưới ảnh hưởng của các nồng độ TDZ và NAA khác nhau sau 8 tuần nuôi cấy 55
Bảng 3.6. Kết quả định lượng các chất ĐHSTTV nội sinh trong chồi cây Hosta tạo từ mẫu lớp mỏng gốc thân dưới ảnh hưởng của các nồng độ TDZ và NAA khác nhau sau 8 tuần nuôi cấy bằng phương pháp HPLC 59
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA lên sự hình thành chồi, hình thành rễ và trọng lượng tươi của mẫu lớp mỏng gốc thân cây Hosta in vitro sau
8 tuần nuôi cấy . 64







Bảng 3.8. Hàm lượng các chất ĐHSTTV nội sinh trong cây Hosta in vitro phát sinh từ mẫu lớp mỏng gốc thân dưới ảnh hưởng của các nồng độ BA và NAA khác nhau sau 8 tuần nuôi cấy đo bằng phương pháp HPLC và phương pháp sinh trắc nghiệm 66
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của thành phần khoáng và vitamin lên sự tăng trưởng của cụm chồi cây Hosta in vitro sau 4 tuần nuôi cấy . 70
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của thành phần khoáng và vitamin lên sự tăng trưởng của cụm chồi cây Hosta in vitro sau 8 tuần nuôi cấy . 72
Bảng 3.11. Hàm lượng các chất ĐHSTTV nội sinh của cụm chồi cây Hosta sau 8 tuần nuôi cấy dưới ảnh hưởng của thành phần khoáng và vitamin đo bằng phương pháp HPLC . 75
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy thoáng khí lên sự tăng trưởng của cụm chồi cây Hosta sau 4 tuần nuôi cấy 79
Bảng 3.13. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy thoáng khí lên sự tăng trưởng của cụm chồi cây Hosta sau 8 tuần nuôi cấy 79
Bảng 3.14. Kết quả định lượng các chất ĐHSTTV nội sinh trong chồi cây Hosta in vitro nuôi cấy trong các điều kiện thoáng khí khác nhau sau 8 tuần nuôi cấy bằng phương pháp HPLC 83









DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Một số giống Hosta dùng làm bonsai cây cảnh . 3

Hình 1.2. Các dạng cây và hoa của cây Hosta 5

Hình 1.3. Các loại lá cây Hosta . 5

Hình 1.4. Hosta Frances Williams 5

Hình 1.5. Bệnh do virus INSV và virus HVX gây ra 8

Hình 1.6. Một số giống Hosta mới năm 2010, 2011 và 2012 10

Hình 1.7. Tạp chí Hosta . 11

Hình 1.8. Triển lãm các loại lá Hosta 11

Hình 1.9. Triển lãm trưng bày Hosta . 11

Hình 1.10. Hiệp hội Hosta Anh quốc 11

Hình 1.11. Cấu trúc của một số loại auxin 15

Hình 1.12. Cấu trúc của một số dạng cytokinin 17

Hình 1.13. Cấu trúc của một số loại gibberellin trong thực vật . 18

Hình 1.14. Con đường tổng hợp ethylen từ tiền chất SAM và các yếu tố tác

động đến con đường tổng hợp của ethylen 18

Hình 1.15. Cấu trúc và vai trò ABA trong sự đóng mở khí khẩu 19

Hình 2.1. Cây Hosta Frances Williams in vitro 30 ngày tuổi trên môi trường

MS có thành phần khoáng đa lượng giảm 1/2 31

Hình 2.2. Phương pháp cắt mẫu lớp mỏng trong nuôi cấy 35

Hình 2.3. Cách sắp xếp mẫu trên đĩa petri thí nghiệm 36

Hình 3.1. Mẫu lớp mỏng phiến lá cây Hosta in vitro sau 4 tuần nuôi cấy 50

Hình 3.2. Mẫu lớp mỏng phiến lá cây Hosta in vitro sau 8 tuần nuôi cấy 50

Hình 3.3. Mẫu phiến lá cây Hosta in vitro ngày đầu tiên nuôi cấy (Ảnh chụp kính hiển vi điện tử SEM) 51
Hình 3.4. Phát sinh hình thái lớp mỏng gốc thân cây Hosta in vitro . 52







Hình 3.5. Mẫu lớp mỏng gốc thân Hosta in vitro sau 8 tuần nuôi cấy trên đĩa

petri 52

Hình 3.6. Mẫu lớp mỏng gốc thân Hosta in vitro sau 8 tuần nuôi cấy 52

Hình 3.7. Cụm chồi cây Hosta từ mẫu cấy lớp mỏng dưới ảnh hưởng của các nồng độ TDZ và NAA khác nhau sau 8 tuần nuôi cấy trên đĩa petri . 57
Hình 3.8. Cụm chồi cây Hosta tạo từ mẫu cấy lớp mỏng dưới ảnh hưởng của các nồng độ TDZ và NAA khác nhau sau 8 tuần nuôi cấy . 58
Hình 3.9. Hình giải phẫu thể hiện sự phát sinh chồi từ mẫu cấy lớp mỏng gốc thân cây Hosta sau 4 tuần nuôi cấy 60
Hình 3.10. Hình giải phẫu mẫu cấy cây Hosta sau 4 tuần nuôi cấy 61

Hình 3.11. Hình giải phẫu mẫu cấy lớp mỏng gốc thân cây Hosta in vitro ở

nghiệm thức T0,5N0,5 . 61

Hình 3.12. Cụm chồi của mẫu lớp mỏng gốc thân cây Hosta in vitro dưới ảnh

hưởng của các nồng độ BA và NAA khác nhau sau 8 tuần nuôi cấy 63

Hình 3.13. Hàm lượng gibberellin nội sinh trong cây Hosta in vitro phát sinh từ mẫu cấy lớp mỏng gốc thân đo bằng phương pháp HPLC, phương pháp sinh trắc nghiệm và tỷ lệ hàm lượng gibberellin đo bằng phương pháp sinh trắc nghiệm với hàm lượng gibberellin đo bằng phương pháp HPLC dưới ảnh hưởng của các nồng độ TDZ và NAA khác nhau sau 8 tuần nuôi cấy . 67
Hình 3.14. Hàm lượng của IAA nội sinh đo bằng phương pháp HPLC và tỷ lệ tạo rễ của mẫu cấy lớp mỏng gốc thân cây Hosta in vitro dưới hưởng của các nồng độ TDZ và NAA khác nhau sau 8 tuần nuôi cấy 68
Hình 3.15. Hàm lượng của IAA nội sinh đo bằng phương pháp HPLC và số chồi hình thành của mẫu cấy lớp mỏng gốc thân cây Hosta in vitro dưới hưởng của các nồng độ TDZ và NAA khác nhau sau 8 tuần nuôi cấy . 68
Hình 3.16. Ảnh hưởng của thành phần khoáng và vitamin lên sự tăng trưởng cụm chồi cây Hosta in vitro nuôi cấy trong hộp Magenta sau 8 tuần 71
Hình 3.17. Ảnh hưởng của thành phần khoáng và vitamin lên sự tăng trưởng cụm chồi cây Hosta in vitro sau 8 tuần nuôi cấy . 71







Hình 3.18. Ảnh hưởng của thành phần khoáng và vitamin lên chỉ tiêu số

chồi/mẫu của cụm chồi cây Hosta in vitro sau 4 và 8 tuần nuôi cấy . 73

Hình 3.19. Sự biến thiên nồng độ ethylen trong hộp nuôi cấy dưới ảnh hưởng của thành phần khoáng và vitamin khác nhau theo thời gian nuôi cấy . 76
Hình 3.20. Sự tương quan giữa nồng độ ethylen tích lũy trong hộp nuôi cấy kín và chỉ tiêu mẫu có lá vàng ở các nghiệm thức có thành phần khoáng và vitamin của môi trường nuôi cấy khác nhau sau 8 tuần nuôi cấy 76
Hình 3.21. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy thoáng khí lên sự tăng trưởng của cụm chồi cây Hosta sau 8 tuần nuôi cấy 78
Hình 3.22. Sự biến thiên nồng độ ethylen trong hộp nuôi cấy trong hộp nuôi cấy dưới ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy thoáng khí khác nhau theo thời gian nuôi cấy 81
Hình 3.23. Sự tương quan giữa nồng độ ethylen tích lũy trong hộp nuôi cấy có độ thoáng khí khác nhau và tỷ lệ mẫu có lá vàng của cụm chồi cây Hosta in vitro sau 8 tuần nuôi cấy 82
Hình 3.24. Sự tương quan giữa nồng độ ethylen tích lũy trong hộp nuôi cấy có

độ thoáng khí khác nhau và chỉ tiêu số lá mở/mẫu sau 8 tuần nuôi cấy 82

Hình 3.25. Sự tương quan giữa nồng độ ethylen tích lũy trong hộp nuôi cấy có

độ thoáng khí khác nhau và hàm lượng ABA sau 8 tuần nuôi cấy 83






MỞ ĐẦU

Hosta là một loài cây cảnh có giá trị về mặt thẩm mỹ cũng như kinh tế. Điểm đặc biệt đầu tiên của loài cây Hosta là sự phong phú về màu sắc của tán lá. Lá có thể thuần nhất 1 màu hay kết hợp đa dạng giữa các màu khác nhau: xanh dương, xanh lá, trắng và vàng. Thứ hai, hoa cây Hosta đẹp có nhiều màu sắc như: hồng, trắng, tím. Đặc biệt, loài hoa trắng có hương thơm. Bên cạnh đó, cây Hosta có sự đa dạng về kích thước. Loài Hosta nhỏ nhất chỉ khoảng 10 cm trong khi loài lớn nhất có thể lên đến 2 m. Hosta là loài thân thảo lâu năm được yêu thích nhất tại Mỹ và được sản xuất với số lượng lớn tại các vườn ươm. Đặc biệt, Hosta Frances Williams luôn nằm trong số mười giống Hosta bán chạy nhất. Mỗi năm, đều có những loài Hosta mới được nghiên cứu, đưa vào thương mại hóa và doanh thu từ loài cây này không ngừng tăng lên. Theo số liệu trên website bán hàng trực tuyến của công ty The Hosta Farm ở Mỹ, từ năm 2010 đến nay, đã có trên 30 loài Hosta mới được đưa vào thương mại hóa. Tuy nhiên, phải mất một thời gian, thường là khoảng 4 đến 5 năm để sản xuất 1 loài Hosta mới có giá thành tương đồng với các loài cũ trong thị trường. Ngoài ra, tình hình về sâu hại và bệnh virus ở cây Hosta cũng là một vấn đề rất phức tạp. Về mặt thương mại, Hosta được nhân giống thông qua nuôi cấy mô trong phòng thí nghiệm. Hosta thường được nhân giống tại nhà thông qua tách cây hay gieo hạt. Tuy nhiên, phương pháp này cho hệ số nhân thấp. Vì vậy, nhân giống in vitro là một công cụ kỹ thuật quan trọng trong chương trình nhân và tạo giống đối với cây Hosta.
Đề tài: “Nghiên cứu sự phát sinh hình thái và tăng trưởng của cây Hosta (Hosta Frances Williams) trong điều kiện nuôi cấy in vitro” được thực hiện, với mục đích tìm hiểu về sự phát sinh hình thái và tăng trưởng của loài cây Hosta Frances Williams trong điều kiện in vitro dưới tác động của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật ngoại sinh. Qua việc thực hiện đề tài, một số phương pháp nghiên cứu sinh trưởng ở thực vật đã được áp dụng.