Đồ Án Nghiên cứu sử dụng môi trường dịch thể để thu nhận enzyme protease từ nấm mốc

ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG MÔI TRƯỜNG DỊCH THỂ ĐỂ THU NHẬN​ ENZYME PROTEASE TỪ NẤM MỐC​ GVHD: GVC LÊ XUÂN PHƯƠNG
SV TH: HỒ THỊ HỒNG LÊ_02H2B
Trong những năm gần đây, ngành công nghệ sinh học phát triển ngày càng mạnh mẽ và thu được nhiều lợi nhuận mang lại lợi ích kinh tế cao. Một trong những lĩnh vực được quan tâm nhiều nhất của công nghệ sinh học là công nghệ sản xuất ra các chế phẩm enzyme đặc biệt là enzyme protease. Trước đây, phần lớn các protease đều được thu từ nội tạng động vật, thực vật nhưng ngày nay nó đang được thay thế dần bằng protease của vi sinh vật rẻ tiền. Thực tế ở nước ta, các chế phẩm enzyme hầu hết phải nhập từ nước ngoài và có giá thành rất cao nên việc ứng dụng chế phẩm enzyme trong sản xuất chưa được rộng rãi. Do đó căn cứ vào nguồn nguyên liệu và điều kiện hiện có tại Việt Nam, đồng thời sử dụng những phương pháp phân tích và phương án ma trận trực giao cấp một trong hoá học, dưới sự hướng dẫn của cô giáo Th.S Lê Xuân Phương, em chọn đề tài "Nghiên cứu sử dụng môi trường dịch thể để thu nhận enzyme protease từ nấm mốc". Mục tiêu của đề tài:
1.Phân lập, tuyển chọn các chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp enzyme protease.
2.Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme protease của nấm mốc trong môi trường dịch thể.
3.Xác định điều kiện tối ưu nuôi cấy nấm mốc sinh tổng hợp protease trong môi trường dịch thể.
Sở dĩ chọn nấm mốc là đối tượng để khảo sát khả năng sinh tổng hợp protease với phương pháp nuôi cấy trong môi trường dịch thể là do vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất enzyme ở qui mô lớn dùng trong công nghiệp và hiện nay trên thế giới, nuôi cấy bề sâu là phương pháp phổ biến nhất trong công nghiệp sản xuất enzyme vi sinh vật.
Chương I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.Tổng quan về vi sinh vật và nấm mốc
Vi sinh vật có mặt ở khắp mọi nơi, thâm nhập vào mọi hoạt động sống của chúng ta. Vai trò của chúng luôn thể hiện ở tính hai mặt. Nắm vững hoạt động của chúng, chúng ta có thể đề ra các biện pháp làm cho chúng trở thành vũ khí sắc bén trong công cuộc chinh phục và cải tạo thiên nhiên để phục vụ con người.
Nấm mốc là tên chung để chỉ các loại nấm hiển vi có cấu tạo sợi. Chúng thuộc loại thực vật hạ đẳng có bào tử, không có diệp lục, không có khả năng tổng hợp các chất hữu cơ từ khí cacbonic mà sử dụng trực tiếp chất hữu cơ sẵn có để sinh sống.
Vi sinh vật nói chung và nấm mốc nói riêng đóng một vai trò vô cùng quan trọng trong việc thúc đẩy sự phát triển của nền kinh tế quốc dân. Đặc biệt là ngành công nghệ sinh học và công nghệ thực phẩm. Nhiều loại nấm mốc có giá trị lớn trong công nghiệp. Chúng được dùng trong việc sản xuất nhiều loại axit hữu cơ, enzyme, chất kháng sinh, vitamin, sản xuất nước chấm, tương, chao; sản xuất rượu
Nhiều chế phẩm enzyme có nguồn gốc vi sinh vật được sản xuất từ nấm mốc, vi khuẩn và xạ khuẩn. Nấm mốc là loại đặc biệt giàu các enzyme ngoại bào.
1.2.Tổng quan về enzyme
Enzyme là chất xúc tác sinh học, có bản chất protein, hoà tan trong nước và trong dung dịch muối loãng, đảm bảo cho quá trình chuyển hoá các chất trong cơ thể sống tiến hành với tốc độ nhịp nhàng, cân đối theo những chiều hướng xác định để đảm bảo cho sự tồn tại của cơ thể sống.
Enzyme có nhiều tính chất ưu việt hơn hẳn các chất xúc tác hoá học. Chính vì những tính chất ưu việt và vai trò to lớn của chúng trong sự sống, enzyme đã trở thành đối tượng rất quan trọng trong nghiên cứu không chỉ các nhà khoa học sinh học, công nghệ sinh học mà còn là mối quan tâm rất lớn của những nhà khoa học trong nhiều lĩnh vực khoa học có liên quan. Trong số các enzyme thì protease được sử dụng rộng rãi nhất chiếm đến 60% tổng hàm lượng enzyme.
Protease là enzyme xúc tác sự thuỷ phân liên kết peptid (CO-NH) trong phân tử protein và các cơ chất tương tự.
Các protease nói chung cũng như protease từ vi sinh vật nói riêng được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: Trong công nghệ chế biến thực phẩm (trong chế biến cá, trong công nghiệp thịt, trong quá trình chế biến sữa và sản xuất phomat, trong công nghiệp sản xuất nước quả và rượu vang, trong sản xuất bia và dịch chiết ngũ cốc, trong công nghệ sản xuất bánh mì và các loại bánh nướng); trong các ngành công nghiệp phi thực phẩm (trong công nghiệp dệt, kỹ nghệ phim ảnh, công nghiệp da); trong công nghiệp dược phẩm và y học; trong nông nghiệp; trong nghiên cứu khoa học
Để thu được enzyme, có hai phương pháp nuôi cấy vi sinh vật: Phương pháp bề mặt và phương pháp bề sâu. Tuy nhiên phương pháp bề mặt không phù hợp trong sản xuất công nghiệp, chỉ sử dụng trong một số nhà máy sản xuất enzyme dưới dạng canh trường. Ngược lại phương pháp bề sâu được sử dụng rộng rãi để sản xuất các chế phẩm enzyme tinh khiết.
Chương II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.Đối tượng nghiên cứu: Canh trường nấm mốc: cơm, vỏ cam, chanh, đất.
2.2.Phương pháp nghiên cứu
2.2.1.Phương pháp vi sinh: Phương pháp chuẩn bị môi trường, phân lập, tuyển chọn và bảo quản giống.
2.2.2.Phương pháp hoá lý: Phương pháp xác định nhiệt độ, pH, độ ẩm, tốc độ lắc.
2.2.3. Phương pháp hoá sinh: Xác định hoạt độ protease bằng phương pháp chuẩn độ foocmol [2].
2.2.4.Phương pháp toán học: Phương pháp quy hoạch thực nghiệm nhiều yếu tố theo phương án trực giao cấp một [1].
Chương III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1.Kết quả phân lập nấm mốc từ nguồn R (cơm), F (vỏ cam, chanh), S (đất)
Từ các nguồn R, F, S, ta có thể phân lập được nhiều chủng nấm mốc với đặc điểm hình thái khuẩn lạc khác nhau. Các chủng nấm mốc từ đất có tốc độ sinh trưởng, phát triển chậm hơn từ nguồn cơm và nguồn vỏ cam, chanh. Vì thế ta không chọn chủng này để làm đối tượng nghiên cứu tiếp theo.
3.2.Kết quả tuyển chọn các chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp protease cao
Bằng phương pháp đo đường kính vòng thủy phân, ta đã tuyển chọn sơ bộ hai chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp protease cao từ các chủng phân lập được: R5 và F1, cho tỉ lệ D/d đạt giá trị cực đại sau 6 này nuôi: D/d(R5) = 1.0700, D/d(F1) = 1.1282, các chủng còn lại không tạo vòng thủy phân tức không có khả năng sinh protease.
3.3. Kết quả khảo sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của chủng F1 và R5
Dựa vào khóa phân loại nấm mốc [3] và thông qua màu sắc bào tử, hình thái tế bào của chủng F1, R5, ta thấy F1 có những đặc điểm giống mốc Pennicillium, R5 có những đặc điểm giống mốc Aspergillus. Đây chính là nguồn nấm mốc chủ đạo trong sinh tổng hợp protease.
3.4.Kết quả khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp protease của nấm mốc F1 và R5 trong môi trường dịch thể
Quá trình nuôi cấy để thu nhận enzyme được thực hiện ở 30OC, trên máy lắc với các tốc độ khác nhau; sử dụng các bình tam giác dung tích 250ml chứa 100ml môi trường.
3.4.1.Ảnh hưởng của môi trường lên men
Tiến hành nuôi thử nghiệm chủng F1 và R5 trên 4 môi trường MT1, MT2, MT3, MT4 ở cùng điều kiện pH = 6 để so sánh khả năng sinh tổng hợp protease của chủng F1và R5 trên các môi trường đó.
Môi trường MT1gồm: NaNO3: 3.5g; MgSO4.7H2O: 0.5 g; KH2PO4: 1.5g; FeSO4.6H2O: 0.01g; KCl: 0.5 g; saccharose: 30g; cao nấm men: 1g; nước cất: 1000ml.
Môi trường MT2 gồm: NaNO3: 3g; MgSO4.7H2O: 0.5 g; KH2PO4: 1g; FeSO4.6H2O: 0.01g; KCl: 0.5g; saccharose: 30g ; cao nấm men: 1g; nước cất: 1000ml.
MT3 gồm: Glucose: 10g; peptone: 5g; KH2PO4: 1g; MgSO4: 0.5g; cao nấm men: 1g;
nước: 1000ml.
MT4 gồm: Bột đậu nành: 50g; dextrin: 25g; saccharose: 30g; Na2CO3: 9g; NaHCO3: 3g; Na3PO4: 3g; cao nấm men: 1g ; nước: 1000ml.
Tiệt trùng ở 121OC trong 20 phút
Kết quả cho thấy hai chủng F1 và R5 đều cho hoạt tính protease mạnh nhất trên môi trường MT4.
Ảnh hưởng của môi trường lên men đến khả năng sinh tổng hợp protease của chủng F1

Ảnh hưởng của môi trường lên men đến khả năng sinh tổng hợp protease của chủng R5




3.4.2.Ảnh hưởng của thời gian lên men
Ta tiến hành nuôi hai chủng F1, R5 trên môi trường lỏng MT4 có pH = 6 rồi tiến hành đo hoạt lực enzyme protease sau những khoảng thời gian nhất định. Kết quả cho thấy trong thời gian đầu (0 – 24h) hoạt tính enzyme protease từ cả hai chủng đều không đáng kể, càng về sau hoạt tính enzyme tăng theo thời gian và đạt giá trị cao nhất nếu thời gian lên men là 48h, càng về sau giá trị này lại giảm.
3.4.3.Ảnh hưởng pH của môi trường lên men
Tiến hành lên men nấm mốc trong môi trường MT4 có pH ban đầu của môi trường khác nhau: 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ở 30OC, tốc độ lắc 300vòng/phút trong 48 h. Kết quả cho thấy hoạt tính protease thu được khá thấp ở những môi trường có pH ban đầu kiềm, và đạt giá trị cực đại ở pH = 6, pH càng thấp hoạt tính protease càng giảm.
3.4.4. Ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng
sinh tổng hợp protease của chủng F1 và R5

Ảnh hưởng của tốc độ lắc
Tiến hành lên men trong môi trường MT4 ở 4 tốc độ lắc khác nhau: 200, 300, 350, 400 vòng/phút và các điều kiện nuôi cấy khác không thay đổi. Kết quả cho thấy khi ta tăng tốc độ lắc hàm lượng oxy tan trong môi trường sẽ tăng thì hoạt tính protease thu được trong canh trường lỏng cũng sẽ tăng theo. Với tốc độ lắc 300 vòng/phút, hoạt tính protease tương đối cao và giá trị đạt cực đại nếu tốc độ lắc là 350 vòng/phút. Nếu ta tăng tốc độ lắc lên cao hơn, hoạt tính enzyme thu được giảm nhẹ.

3.5.Xác định điều kiện tối ưu lên men nấm mốc sinh tổng hợp protease trong môi trường dịch thể
Kết quả thí nghiệm ở trên cho thấy chủng F1 luôn cho protease có hoạt tính cao hơn so với R5. Do đó ta chọn chủng F1 để tiến hành tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy để sinh
tổng hợp protease.
Các yếu tố được chọn để tối ưu: pH của môi trường lên men: x1, thời gian lên men (h): x2
Chỉ tiêu cần tối ưu là hoạt lực enzyme protease (đvhđ/ml) ký hiệu là y: y max
Bằng cách sử dụng phương pháp quy hoạch thực nghiệm theo phương án trực giao cấp một, ta đã xác định mối quan hệ giữa pH môi trường và thời gian lên men với hoạt tính enzyme protease thu được trong phương pháp nuôi cấy ở môi trường lỏng theo phương trình hồi quy: . Ý nghĩa các hệ số trong phương trình hồi quy đã được kiểm tra theo tiêu chuẩn Student. Sự tương thích của phương tình hồi quy với thực nghiệm được kiểm tra theo tiêu chuẩn Fisher. Điều kiện tối ưu cho quá trình sinh tổng hợp protease của F1 trong môi trường dịch thể là: môi trường MT4, pH = 6.5, thời gian lên men 50h, tốc độ lắc 300 vòng/phút ở 30OC.
Chương IV: KẾT LUẬN
1. Trên các loại canh trường khác nhau như: cơm, vỏ cam, chanh, đất chúng ta có thể phân lập được nhiều loại nấm mốc với các đặc tính về hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào khác nhau trong cùng một điều kiện thí nghiệm.
2. Đã tuyển chọn sơ bộ hai chủng R5 và F1 có khả năng sinh tổng hợp protease cao.
3. Chủng F1 có những đặc tính giống mốc Pennicillium, chủng R5 giống mốc Aspergillus.
4. Đã chọn được điều kiện thích hợp nhất cho sự sinh tổng hợp protease của hai chủng F1 và R5 trong môi trường dịch thể: Môi trường MT4 có pH = 6, thời gian lên men 48h, tốc độ lắc 350 vòng/phút.
5. Các điều kiện tối ưu cho sự sinh tổng hợp protease trong môi trường dịch thể: Môi trường MT4 có pH = 6.5, thời gian lên men 50h, ở 30OC, tốc độ lắc 300vòng/phút.
6. Đề xuất các hướng nghiên cứu tiếp theo:
-Tối ưu hóa đồng thời nhiều yếu tố như nhiệt độ, tốc độ lắc, pH, thời gian nuôi, tỷ lệ giống để quá trình nuôi cấy nấm mốc cho hoạt lực protease cao.
-Lựa chọn phương pháp tối ưu để tinh sạch enzyme protease thô được sinh tổng hợp từ môi trường dịch thể nuôi cấy nấm mốc.
-Nghiên cứu ứng dụng enzyme protease trong các ngành sản xuất công nghiệp.
TÀI LIỆU THAM KHẢO​ 1.Nguyễn Cảnh (1993), Quy hoạch thực nghiệm, Trường Đại học bách khoa TP HCM.
2.Nguyễn Trọng Cẩn (chủ biên), Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến (1998), Công nghệ enzym, Nxb Nông Nghiệp TP HCM.
3.Nguyễn Đức Lượng (chủ biên), Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết, Thí nghiệm công nghệ sinh học tập 2, Nxb Đại Học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh.
4.PTS. Nguyễn Đức Lượng, Nguyễn Chúc, Lê Văn Việt Mẫn, Thực tập vi sinh vật học thực phẩm, Trường Đại Học Bách Khoa TP Hồ Chí Minh.
5.Tạp chí Khoa Học và Công Nghệ các trường Đại Học Kỹ Thuật, số 54 – 2005.
6.http://www.dost.hochiminhcity.gov.vn/data/news/2003/10/994/14congnghesinhhoc.htm