Thạc Sĩ Nghiên cứu sử dụng gen Coda làm chỉ thị chọn lọc tạo vector chuyển gen mang tính an toàn sinh học

ii


LỜI CÁM ƠN

Để hoàn thành bản Luận văn này, ngoài sự cố gắng nỗ lực của bản thân, tôi
đã nhận được những sự quan tâm giúp đỡ của rất nhiều cá nhân và tập thể.
Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc của mình đến PGS.TS Chu
Hoàng Hà – Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học, người đã dành nhiều thời gian,
tâm huyết, tận tình giúp đỡ và trực tiếp hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực
hiện Luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn sự quan tâm, chỉ bảo của TS. Phạm Bích Ngọc,
KS. Nguyễn Đình Trọng, ThS. Lê Thu Ngọc và đồng cám ơn các cán bộ Phòng
Công nghệ tế bào thực vật, Phòng Công nghệ ADN ứng dụng, Phòng Thí nghiệm
trọng điểm Công nghệ gen – Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm khoa học và
công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình
thực hiện đề tài.
Cuối cùng tôi xin gửi tới thầy cô Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái
Nguyên, bạn bè và tập thể lớp cao học công nghệ sinh K6A lời cám ơn cùng những
tình cảm chân thành nhất vì những sự động viên giúp đỡ quý báu mà mọi người đã
dành cho tôi trong suốt thời gian qua.
Tôi xin chân thành cám ơn!

Hà Nội, ngày tháng 5 năm 2015
Học viên


Nguyễn Thị Hà


iii


MỤC LỤC
Trang
Lời cam đoan . i
Lời cảm ơn ii
Mục lục iii
Danh mục các chữ viết tắt và ký hiệu v
Danh mục bảng vii
Danh mục hình viii
MỞ ĐẦU . 1
1. Tính cấp thiết của đề tài 1
2. Mục tiêu nghiên cứu 2
3. Nội dung nghiên cứu . 3
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
1.1. Ảnh hưởng của một số điều kiện bất lợi của môi trường tới thực vật 4
1.1.1. Sự ảnh hưởng của nhiệt độ cao đến thực vật 4
1.1.2. Sự ảnh hưởng của hạn hán tới thực vật: 5
1.1.3. Sự ảnh hưởng của đất nhiễm mặn tới thực vật 7
1.2. Cơ chế chống chịu của thực vật với các điều kiện bất lợi của môi trường . 9
1.2.1. Hệ thống vetor liên hợp . 9
1.2.2. Vetor nhị thể 10
1.3. Các gen sử dụng trong chọn lọc và chỉ thị . 10
1.3.1. Gen kháng kháng sinh 10
1.3.2. Gen kháng chất diệt cỏ 11
1.3.3.Gen chọn lọc mannose
11
1.3.4.Các gen chỉ thị: GFP (green fluorescene protein), GUS (β-1,4-
glucuronidase)

12
1.4. Tổng quan nghiên cứu về vector chuyển gen mang tính an toàn sinh học
12
1.4.1. Sự cần thiết nghiên cứu vector chuyển gen mang tính an toàn sinh học .
12
1.4.2. Các gen/hệ thống chọn lọc thân thiện .
13
1.4.3. Sự loại bỏ các gen chỉ thị chọn lọc từ cây chuyển gen . 16
1.5.Cơ sở khoa học trong sử dụng gen codA làm chỉ thị chọn lọc ở thực vật
chuyển gen .

19
1.5.1. Giới thiệu về gen codA 19
1.5.2. Các nghiên cứu chuyển gen codA nhằm tăng cường khả năng chống chịu
ở thực vật

20
CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 iv


2.1. Vật liệu nghiên cứu 23
2.1.1. Vật liệu thực vật 23
2.1.2. Các chủng vi khuẩn, vector và cặp mồi sử dụng 23
2.1.3. Hóa chất, thiết bị 25
2.1.3.1. Hóa chất . 25
2.1.3.2. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 26
2.2. Phương pháp nghiên cứu 26
2.2.1. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) 26
2.2.2. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose . 27
2.2.3. Phương pháp tinh sạch DNA từ gel agarose 28
2.2.4. Phương pháp xử lý ADN bằng enzyme hạn chế 28
2.2.5. Phản ứng nối ghép gen 29
2.2.6. Phương pháp biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến
E.coli .

29
2.2.7. Phương pháp tách chiết plasmid tái tổ hợp 30
2.2.8. Phương pháp biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến
A.tumefaciens C58/PGV2260 bằng xung điện .

31
2.2.9. Phương pháp tạo cây thuốc lá chuyển gen . 32
2.2.10. Kiểm tra sự biểu hiện của gen chuyển ở mức độ phiên mã bằng kỹ thuật
RT-PCR .

33
2.2.11. Đánh giá khả năng chịu nhiệt của các dòng thuốc lá K326 chuyển gen
codA .

35
2.2.12. Sàng lọc khả năng chịu mặn của dòng thuốc lá chuyển gen in vitro 36
2.2.13. Phương pháp tính toán và xử lý số liệu 36
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 37
3.1. Thiết kế vector chuyển gen pCAMBIA1301/HSP-codA mang gen codA


37
3.1.1. Thiết kế vector chuyển gen pCAMBIA1301/35S-codA mang gen codA
hoạt động dưới sự điều khiển của promoter cơ định
35S

38
3.1.2.Thiết kế vector pCAMBIA1301/HSP-codA mang gen codA hoạt động
dưới sự điều khiển của promoter HSP 18.2

39
3.1.3.Loại bỏ gen chọn lọc hptII mã hóa cho hygromycin phosphotransferase
khỏi vector pCAMBIA1301/HSP-codA

41
3.1.4.Tạo chủng Agrobacterium tumefaciens mang vector chuyển gen . 42
3.2 . Kết quả chuyển gen codA vào cây thuốc lá K326 . 44
3.2.1.Chuyển cấu trúc pCAMBIA1301/HSP-codA vào cây thuốc lá thông qua vi
khuẩn A. tumefaciens

44 v



3.2.2.Sàng lọc khả năng chịu nhiệt của dòng thuốc lá chuyển gen trong in vitro
.

45
3.2.3.Phân tích các dòng cây chuyển gen bằng kỹ thuật PCR . 47
3.2.4. Sàng lọc khả năng chịu mặn của dòng thuốc lá chuyển gen trong in
vitro .

48
3.2.5. Phân tích cây thuốc lá chuyển gen codA bằng kỹ thuật RT-PCR 48
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ . 50
TÀI LIỆU THAM KHẢO . 51

















vi


DANH MỤC BẢNG

Tên bảng Trang
Bảng 1.4a. Một số chỉ thị chọn lọc tích cực an toàn có/không nguồn gốc từ
thực vật

15-16
Bảng 1.4b. Một số hệ thống loại bỏ chỉ thị chọn lọc từ cây chuyển
gen

17-18
Bảng 1.5. Một số loài cây trồng chuyển gen codA đã được chứng minh là có
khả năng chống chịu tốt với điều kiện stress

21-22
Bảng 2. 1. Các cặp mồi đặc hiệu cho gen codA và promoter HSP18.2 25
Bảng 2.2: Chu kì phản ứng PCR nhân gen codA . 27
Bảng 2.3: Môi trường nuôi khuẩn . 31
Bảng 2.4 : Môi trường nuôi và chọn lọc cây thuốc lá chuyển gen 32
Bảng 2.5: Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA . 33
Bảng 2.6: Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA 33
Bảng 2.7: Thành phần phản ứng PCR nhân gen actin từ cDNA 34
Bảng 2.8: Thành phần phản ứng PCR nhân gen codA từ cDNA 35
Bảng 3.1: Kết quả chuyển gen codA vào thuốc lá giống K326 45
Bảng 3.2: Dòng thuốc lá chuyển gen codA ra rễ trên môi trường 200 mM
NaCl

48



vii


DANH MỤC HÌNH
Hình 1. 1. Sơ đồ cấu trúc Ti-plasmid của vi khuẩn A. Tumefaciens . 8
Hình 1.2. Quy trình sử dụng manose làm chất chọn lọc 11
Hình 2.1: Vector pCAMBIA1301 . 24
Hình 2.2: Vector pBI121 . 24
Hình 3.1. Sơ đồ thiết kế vector chuyển gen . 37
Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm cắt các vector pBI121/35S-codA (1) và
pCAMBIA1301 (2) bằng cặp enzyme cắt hạn chế HindIII và EcoRI (A) và sản
phẩm tinh sạch các đoạn gen(B)


38
Hình 3.3. Kết quả điện di sản phẩm cắt kiểm tra vector tái tổ hợp
pCAMBIA1301/35S-codA bằng cặp enzyme cắt hạn chế HindIII và
EcoRI


39
Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm tinh sạch các phân đoạn gen mong muốn
sau khi xử lý các vector pBT/HSP và pCAMBIA1301/35S-codA bằng cặp
enzyme hạn chế HindIII và XbaI. (2): vector pCAMBIA1301/35S-codA đã loại
bỏ promoter 35S; (1) promoter HSP18.2



40
Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR sàng lọc các dòng khuẩn mang
plasmid tái tổ hợp pCAMBIA1301/HSP-codA bằng cặp mồi đặc hiệu F/HSP-
XbaI và R/HSP-HindIII .


40
Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm cắt kiểm tra vector tái tổ hợp
pCAMBIA1301/HSP-codA bằng cặp enzyme cắt hạn chế HindIII và XbaI .

41
Hình 3.7. Cắt loại bỏ gen hptII khỏi vector pCAMBIA1301/HSP-codA bằng viii


enzyme hạn chế XhoI. . 42
Hình 3.8. Kết quả điện di kiểm tra vector pCAMBIA1301/HSP-codA trước (1)
và sau (2) khi loại bỏ gen hptII

42
Hình 3.9. Khuẩn lạc A. tumefacies biến nạp vector chuyển gen
pCAMBIA/HSP-codA mọc trên môi trường LB bổ sung 50 mg/l kanamycin

43
Hình 3.10. Sản phẩm PCR nhân gen codA từ 3 dòng plasmid tách từ A.
tumefaciens.

43
Hình 3.11. Sơ đồ chuyển gen vào thuốc lá thông qua vi khuẩn A.tumefaciens . 44
Hình 3.12. Mảnh lá chuyển gen codA tái sinh trên MT CT2 ở nhiệt độ 37 o
C
sau 2 tuần

46
Hình 3.13. Cụm chồi tái sinh từ mảnh lá trên MT CT2 ở nhiệt độ 37 o
C sau 3
tuần
46
Hình 3.14. Chồi thuốc lá trên môi trường ra rễ ở nhiệt độ 37 o
C 47
Hình 3.15. Sản phẩm PCR nhân gen codA từ cây thuốc lá chuyển gen 47
Hình 3.16: Các dòng thuốc lá chuyển gen codA và không chuyển gen trên môi
trường ra rễ có 200 mM NaCl

48
Hình 3.17: Sản phẩm RT-PCR từ mRNA của các dòng thuốc lá K326 chuyển
gen codA

49




ix


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KỲ HIỆU

STT KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT
1 A.globiformic Arthrobacter globiformic
2 A.tumefaciens Agrobacterium tumefaciens
3 DNA Acid Deoxiribonucleic
4 BHDA Betain aldehycle dehydrogenase
5 BA 6-benzyl adenine
6 bp Base pair
7 CaMV Cailiflower Mosaic Virus
8 cDNA Complementary DNA
9 Cefo Cefotaxime
10 CMO Choline monooxygenase
11 CODA Choline oxidase
12 ĐC Đối chứng
13 E.coli Escherichia coli
14 EDTA Ethylene Diamine Tetra acetic Acid
15 et al Đồng tác giả
16 EtBr Ethidium Bromid
17 GB Glycine betaine
18 Genta Gentamycine
19 GFP Green Fluorescent Protein
20 GUS β -1, 4-Glucuronidase
21 HSF Heat shock factor
22 HSPs Heat shock proteins
23 Hyg Hygromycine resistant
24 ISSR Inter Simple Sequence Repat
25 Kana Kanamycine x


26 LB Luria Bertani
27 M Thang Marker chuẩn
28 MDA Malondialdehyde
29 mM Millimolar
30 MT Môi trường
31 MS Murashige and Skoog, 1962
32 MT-sHSP Mitochondrial small Heat shock protein
33 MUG 4-methyl-umBelliferyl- β -D-glucoronide
34 µl Micro litte
35 µM Micromolar
36 NptII Neomycin Phosphotransferaces II
37 PCR Polymerase Chain Reaction
38 QTL Quantitative trait loci
39 RAPD Random Amplified Polymorphic DNA
40 Rifa Rifamycine
41 SOD Superoxide dismutase
42 T-DNA Transfer-DNA
43 TAE Tris-acetate –EDTA
44 Ti-plasmid Tumor-Inducing Plasmid
45 TP Transit peptide
46 Vir Virulence
47 WT Dòng không chuyển gen
48 X-Gluc 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- β -D-glucoronide
49 NAA 1-Naphthaleneacetic acid
1


MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của đề tài
Cây trồng biến đổi gen (Genetically Modified Crop - GMC) là loại cây trồng
được lai tạo ra bằng cách sử dụng các kỹ thuật công nghệ sinh học hiện đại, hay
còn gọi là kỹ thuật di truyền, công nghệ gen hay công nghệ DNA tái tổ hợp, chuyển
một hoặc một số gen chọn lọc để tạo ra cây trồng mang tính trạng mong muốn. Về
mặt bản chất, các giống lai từ trước đến nay (hay còn gọi là giống truyền thống)
đều là kết quả của quá trình cải biến di truyền. Điểm khác biệt duy nhất giữa giống
lai truyền thống và giống chuyển gen là gen (DNA) được chọn lọc một cách chính
xác dựa trên khoa học công nghệ hiện đại, chuyển vào giống cây trồng để đem lại
một tính trạng mong muốn một cách có kiểm soát.
Việc sử dụng các gen có khả năng chọn lọc đi kèm với gen đích trong kỹ
thuật chuyển gen là rất cần thiết nhằm tìm ra được một lượng ít các tế bào mang
gen cần chuyển trong vô số các tế bào không mang gen chuyển. Thông thường các
gen chọn lọc được dùng là các gen kháng lại kháng sinh như hygromycin (hpt) và
kanamycin (nptII) hoặc kháng lại các chất diệt cỏ như phosphinothricin (bar) và
chlorosulfuron (als).
Mặc dù, cho đến hiện nay chưa có thí nghiệm nào đưa ra được bằng chứng
rằng các gen chọn lọc kháng lại các chất kháng sinh hay thuốc diệt cỏ đang sử dụng
có nguy cơ gây hại đến sức khỏe người hoặc vật nuôi nhưng vẫn có những lo ngại
về độ an toàn với sức khỏe con người và ảnh hưởng đến đa dạng sinh học. Vì vậy,
trong những năm gần đây đã có những nghiên cứu liên quan đến việc sử dụng các
gen chọn lọc thay thế, không ảnh hưởng đến hoạt động sinh học của tế bào thực vật
hay còn gọi là chọn lọc tích cực (positive selection). Trong trường hợp này, các tế
bào chuyển gen sẽ sử dụng một số chất không độc hại mà trong điều kiện bình
thường không thể sử dụng. Việc thay thế các gen chọn lọc này bằng những gen có
tính chất tích cực, thân thiện với môi trường cũng đang là vấn đề được quan tâm
trong các nghiên cứu chuyển gen vào thực vật.
Glycine betaine (GB) và proline được biết đến là một trong những chất đóng
vai trò quan trọng trong quá trình điều chỉnh áp suất thẩm thấu nội bào khi thực vật
sống trong các điều kiện bất lợi như khô, hạn, lạnh . Trong tế bào thực vật, 2


glycine betaine được tổng hợp từ choline thông qua hai phản ứng liên tiếp được xúc
tác bởi choline monooxygenase (CMO) và betain aldehyde dehydrogenase
(BADH) 54 .
Từ những hiểu biết về con đường sinh tổng hợp glycine betaine và proline ở
sinh vật, cùng với sự phát triển mãnh mẽ của lĩnh vực công nghệ gen, đặc biệt là kỹ
thuật tạo cây trồng biến đổi gen. Các nhà khoa học đã phân lập được các gen: codA
(COD-Choline oxidase), COX, BADH, betA (CDH), CMO, GSMT(glicine
Sarcosine methyntransferase), SDMT (Sarcosine dimethylglucine
methyltransferase), P5CS (Pyrroline -5-Carboxylate Synthetase) và P5CR
(Pyrroline -5-Carboxylate) từ nhiều nguồn khác nhau, mã hóa cho các enzyme
tham gia vào quá trình sinh tổng hợp GB và proline. Các gen này đã được thiết kế
với các promoter biểu hiện đặc hiệu, mạnh và chuyển thành công vào nhiều loài
cây trồng, các loài cây trồng biến đổi gen tăng cường khả năng chống chịu điều
kiện bất lợi của môi trường. Các kết quả đã được công bố : các gen codA
(COD), COX, BADH, betA (CDH), CMO, GSMT, SDMT, P5CS và P5CR được
chuyển vào các đối tượng cây Arabidopsis thaliana, Cây thuốc lá, cây lúa (Oryza
sativa), cây cà chua, cây hồng, cây bạ (Brassica juncea
, nhi , chị
giá codA là gen mã hóa cho choline oxidase là enzyme tham gia tổng hợp GB.
Trong chuyển gen, các nhà khoa học đã sử dụng gen codA (COD) cho thấy cây
chuyển gen có khả năng phát triển bình thường trong điều kiện bất lợi như nóng,
mặn, khô hạn xảy ra.
Với lý do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu sử dụng
gen codA làm chỉ thị chọn lọc tạo vector chuyển gen mang tính an toàn sinh
học”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Mục tiêu chung: Phát triển vector chuyển gen mới có gen chọn lọc là codA
phục vụ việc nâng cao hiệu quả chuyển gen và tính an toàn của cây chuyển gen.
Mục tiêu cụ thể:
- Tạo được vector chuyển gen thực vật có gen chọn lọc là gen codA.
- Đánh giá được khả năng chọn lọc và hiệu quả tạo cây chuyển gen sử dụng
vector chuyển gen mới tạo được có gen chọn lọc là gen codA. 3


- Xây dựng được quy trình tạo cây chuyển gen sử dụng vector chuyển gen và
gen chọn lọc codA đối với mô hình cây thuốc lá
3. Nội dung nghiên cứu
(1) Thiết kế vector chuyển gen mang gen codA thay thế cho gen chọn lọc
(kháng kháng sinh).
(2) Thử nghiệm tạo và đánh giá khả năng tạo cây chuyển gen thông qua chọn
lọc bằng điều kiện chống chịu nhiệt độ cao, chịu mặn.
(3) Xây dựng quy trình chọn lọc và tạo cây chuyển gen sử dụng vector
chuyển gen và gen chọn lọc codA trên mô hình cây thuốc lá.