Thạc Sĩ Nghiên cứu sử dụng enzyme protease trong qui trình sản xuất chitin - chitosan

Luận văn thạc sĩ
Đề tài: NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG ENZYME PROTEASE TRONG QUI TRÌNH SẢN XUẤT CHITIN - CHITOSAN

MỤC LỤC
Trang
DANH MỤC KÍ HIỆU VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
MỞ ĐẦU . 1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. GIỚI THIỆU VỀ PHẾ LIỆU TÔM VÀ CÁC HƯỚNG TẬN DỤNG . 3
1.1.1. Phế liệu tôm . 3
1.1.2. Thành phần hóa học của phế liệu tôm . 4
1.1.3. Các hướng tận dụng phế liệu tôm 5
1.2. CÁC SẢN PHẨM CÓ GIÁ TRỊ TỪ PHẾ LIỆUTÔM . 6
1.2.1. CHITIN, CHITOSAN . 6
1.2.1.1. Giới thiệu chung về chitin, chitosan . 6
1.2.1.3. Tình hình nghiên cứu sản xuất chitin,chitosan trên thế giới và
Việt Nam . 8
1.2.2. PROTEIN VÀ ASTAXANTHIN 21
1.2.2.1. Astaxanthin trong phế liệu tôm . 21
1.2.2.2. Các phương pháp thu nhận protein và astaxanthin 26
1.2.2.3. Nghiên cứu thu hồi chitin, protein và astaxanthin bằng phương pháp
sử dụng enzyme 29
1.3. BẢN CHẤT, CƠ CHẾ VÀ CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ
TRÌNH THỦY PHÂN 33
Chương 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 38
2.1. Nguyên vật liệu nghiên cứu 38
2.2. Phương pháp nghiên cứu . 39
2.2.1. Phương pháp thu nhận mẫu . 39
2.2.2. Bố trí thí nghiệm xác định các thông số quy trình . 40
2.2.3. Bố trí thí nghiệm xác định các điều kiện thích hợp cho quá trình thủy
ii
phân protein đầu vỏ tôm bằng enzyme Alcalase 41
2.2.4. Bố trí thí nghiệm xác định chế độchiết astaxanthin từ phế liệu tôm 44
2.2.5. Các phương pháp phân tích . 48
2.2.6. Phương pháp xử lý số liệu . 50
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 51
3.1. Thành phần hóa học của phế liệu tôm Thẻ 51
3.2. Ảnh hưởng của các yếu tố bên ngoài đến quá trình tách protein . 51
3.2.1. Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme Alcalase/nguyên liệu 51
3.2.2. Ảnh hưởng của pH đến quá trình thủy phân . 54
3.2.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân . 56
3.2.4. Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình thủy phân 57
3.2.5. Tối ưu hóa công đoạn tách protein của vỏ đầu tô m bằng enzyme Alcalase 59
3.3. Kết quả lựa chọn chế độ thích hợp để thu hồi asthaxanthin . 64
3.3.1. Xác định môi trường và thời gian thích hợp để chiết astaxanthin . 64
3.3.2. Xác định nhiệt độ thích hợp để chiết astaxanthin 66
3.3.3. Xác định tỷ lệ dung môi/nguyên liệu thích hợp để chiết astaxanthin 67
3.3.4. Tối ưu hóa quá trình chiết astaxanthin 68
3.4. Đề xuất qui trình ứng dụng enzyme protease trongcông nghệ sản xuất
chitin 73
3.5. Đánh giá sơ bộ hiệu quả quy tr ình sử dụng enzyme so với ph ương pháp
hóa học . 76
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 80
TÀI LIỆU THAM KHẢO

MỞ ĐẦU
Xuất khẩu thủy sản của Việt Nam đã phát tri ển mạnh trong những năm gần
đây và trở thành ngành kinh tế quan trọng, tạo công ăn việc làm, tăng thu nhập cho
hàng triệu người dân ven biển và tạo nguồn thu ngoại tệ đáng kể cho đất nước.Theo
thống kê của Tổng cục Hải quan, n ăm 2006 kim ng ạch xuất khẩu thủy sản đ ã qua
mốc 3 tỷ đạt 3,31 tỷ USD, tăng gần 600 triệu USD so với năm 2 005, trong đó mặt
hàng tôm truyền thống chiếm vị trí đầu bảng xấp xỉ 1,5 tỷ USD, chiếm 44,3 % tổng
kim ngạch xuất khẩu. Năm 2007kim ngạch xuất khẩu thủysản đạt gần 3,8 tỷUSD,
tăng 12% so v ới năm 2006, xuất khẩu tôm đông lạnh chiếm 40% tổng kim ng ạch
xuất khẩu.Cùng v ới sự gia tăng khối lượng tôm xuất khẩu th ì m ột lượng lớn phế
liệucủa ng ành chế biến tôm thải ra. Phế liệu n ày có th ể chiếm tới 40 ư60% trọng
lượng của tôm nguy ên liệuvà nó có ch ứa các th ành phần có g iá tr ị nh ư protein,
chitin, astaxanthin. Theo ước tính thành phần của protein t rong đầu tôm Thẻ chiếm
khoảng 11% trọng lượng tươi và như thế cứ sản xu ất 1 kg chitin thì sẽ thải hồihơn
2kg protein. Ngoài ra, còn chứa đáng kể astaxanthin (300mg/kg). Lượng astaxanthin
nàycó giá trị kinh tế rất cao (khoảng 2.500 USD/kg) đ ược ứng dụngtrong nuôi thủy
sản nhằm tạo ra sắc tố đỏ cam t rong tôm, cua, cá hồi, cá hồng , cá cảnh, đồng thời
tăng cường sức đề kháng, nâng cao sứcsống và khả năng sinh sản của các loài động
vật này. Astaxanthin cũng có những ứng dụng quan trọng khác trong thực phẩmchức
năng, trong mỹ phẩm và trong công nghiệp thực phẩm.
Chitin và d ẫn xuất của nó chitosan đ ược ứng dụng rộng r ãi không ch ỉ trong
công nghiệp thực phẩm m à còn trong công nghi ệp dược, mỹ phẩm, xử lý n ước thải
và trong nông nghi ệp. Nhiều công tr ình nghiên c ứu sản xuất chitin -chitosan trong
và ngoài nư ớc đã và đang thực hiện với nhiều ph ương pháp khác nhau. Đa số các
quy trình s ản xu ất chitin -chitosan dùng kiềm mạnh để khử protein dẫn đến d ịch
protein thu đư ợc sau quá tr ình th ường thải bỏ do có nồng độ hóa chất cao,gây ô
nhiễm môi trường nghiêm trọng. Hơn n ữa, protein bị hạn chế sử dụng do c ác phản
ứng không mong muốn giữ a amino acid x ảy ra trong môi tr ường kiềm mạnh , bên
cạnh đó c òn có s ự kết bông các amino acid. Thu h ồi một phần protein từ phế liệ u
tôm bằngsự thủy phân enzymelà r ất cần thiết. Protein thu hồi có thể sử dụng nh ư
chất tạo mùi và bổ sung vào surimi hay thức ăn chăn nuôi. Hơn nữa, sản phẩm thủy
2
phân cũng là nguồn peptid hoạt động sinh học, với tiềm năng đáng k ể trong d ược
học, đồng thời là tác nhânkích thích tăng trưởng trong thức ăn động vật.
Trong những năm gần đây nghiên c ứu ứng dụng enzyme cho việc thu hồi
chitin, protein, astaxanthin đ ã và đang được sự quan tâm của nhiều nhà khoa h ọc,
cáccơ s ở nghiên cứu sản xuất trong v à ngoài nư ớc. Tuy nhiênđể hoàn thiện quy
trình s ản xuất v à nâng cao ch ất lượng sản phẩm đòi hỏi phải nghiên cứu sâu h ơn
nữa. Chính v ì v ậy, tôi tiến hành thực hiện đề t ài: “Nghiên cứu sử dụng enzyme
Protease trong quitrình s ản xuất Chitin –Chitosan” dưới sự hướng dẫn khoa
học của TS. Trang Sĩ Trung.
Mục tiêu của đề tài:
Xác định các điều kiện thích hợp để tách protein từ phế liệu tôm Thẻ chân trắng
(Penaeus vannamei) bằng enzyme Alcalasenhằm giảm thiểu hóa chất sử dụng, giảm ô
nhiễm môi trường, đồng thời đưa ra biện pháp thu hồi protein-astaxanthin.
Nội dung của đề tài:
- Xác định thông số tối ưu cho quá trình táchprotein bằng enzymeprotease:
tỷ lệ enzyme/nguyên liệu, pH, nhiệt độ, thời gian thủy phân. Đề xuất quytrình ứng
dụng enzymevào quá trình sản xuất chitin từ phếliệu tôm.
- So sánh chất lượng chitin-chitosan sản xuất từ quytrình ứng dụng enzyme
với quytrình hóa học truyền thống.
-Xác định thông số thích hợp cho quátrình chiết astaxanthin.
- Đánh giá chất lượng của hỗn hợp carotenoprotein thu đượctừ quá trình sản
xuất chitin.
3
Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. GIỚI THIỆU VỀ PHẾ LIỆU TÔM VÀ CÁC HƯỚNG TẬN DỤNG
1.1.1. Phế liệu tôm
Theo thống kê của Trung tâm Nghiên cứu Chế biến Thủy sản, Đại học Thuỷ
sản thì lượng phế liệu năm 2004 tại Việt Nam ước tính khoảng 45.000 tấn phế liệu,
năm 2005 ước tính khoảng 70.000 tấn/năm.Trần Thị Luyến (2004) cho biết trong vỏ
tôm tươi chitosan chi ếm khoảng 5% khối l ượng, trong vỏ tôm khô khoảng 2 0-40%
khối lượng. Như vậy h àng năm có th ể sản xuất gần 5000 tấn chitos an phục v ụ sản
xuất trong nước và xuất khẩu, mang lại hiệu quả kin h tế cho ngành Thuỷ sản [8].
Phế liệu tôm chủ yếu l à đầu và các m ảnh vỏ, ngoài ra còn ph ải kể đến phần
thịt vụn do bóc n õn không c ẩn thận, một số tôm bị hỏng. Tuỳ theo giống lo ài,
phương pháp gia côn g chế biến m à lượng phế liệu có thể l ên đến 60% sản l ượng
khai thác được. Ví dụ tôm càng xanh, phần đầu tôm chiếm khoảng 60% kh ối lượng
toàn bộ, với tôm sú th ì đầu chiếm khoảng 40% so với khố i lượng toàn bộ. Đối với
sản phẩm tôm bóc nõn và rút ruột mất máttheo vỏ và đuôi khoảng 25%.
Nhiều công tr ình nghiên c ứu cho thấy tỷ lệ của phế liệu tôm từ 30 -70%
(Watkin và cộng sự, 1982 [50]. Holanda và Netto (2006) cho r ằng phế liệu tôm có
thể chiếm 50-70% so với nguyên liệu [32].
Phần lớn tôm đ ược đưa vào ch ế biến dưới dạng bóc vỏ, bỏ đầu. Phần đ ầu
thường chiếm khối l ượng 34 -45%, ph ần vỏ, đuôi v à chân chi ếm 10 -15% tr ọng
lượng của tôm nguyên li ệu. Tuy nhi ên, tỷl ệ này tuỳ thuộc v ào giống loài và giai
đoạn sinh trưởng của chúng [8] [9].
4
Bảng 1.1. Thành phần khối lượng củamột số loài tôm [9]
Loàitôm Tôm vỏ bỏ đầu(%) Tôm thịt(%) Đầu tôm(%) Vỏ tôm(%)
He 61,19 52,05 29,80 10,00
Thẻ 62,95 53,62 28,00 9,00
Sú 61,96 52,84 31,40 8,90
Rằn 58,23 48,60 33,90 10,40
Gân 59,30 41,45 33,14 11,27
Chì 57,71 47,43 31,85 11,07
Bột 60,32 49,02 31,55 12,15
Rảo 58,68 46,49 33,20 12,20
Vàng 60,25 48,04 31,75 13,07
Sắt 50,47 39,15 42,38 11,62
Càng 40,22 31,61 51,95 8,56
Hùm 28,07 22,20 63,40 5,50
Mũ ni 41,52 30,74 52,02 12,57
1.1.2. Thành phần hóa học của phế liệu tôm
Thành phần chiếm tỷ lệ đáng kể trong đ ầu tôm là protein, chitin, khoáng, sắc tố.
Tỷ lệ các thành phần này không ổn định, chúng thay đổi theo g iống, lo ài, đặc điểm sinh
thái, sinh lý, Thành phần chitin và protein trong vỏ tôm tươi tương ứng là 4,50% và
8,05%. Trong vỏ tôm khô l à 11 –27,50% và 23,25 –53%.
Hàm lượng chitin, protein, khoáng v à carotenoid trong ph ế liệu vỏ tôm thay
đổi rất rộng phụ thuộc v ào điều kiện bóc vỏ trong quá tr ình chế biến cũng nh ư phụ
thuộc vào loài, trạng thái dinh dưỡng, chu kỳ sinh sản. Vỏ giáp xác chứa chủ yếu l à
protein (30 –40%), khoáng (30 –50%), chitin (13 –42%) [45].

TÀI LIỆU THAM KHẢO
TIẾNG VIỆT
1. Hoàng Thị Huệ An (2003), Nghiên cứu chiết suất as taxanthin t ừ phế liệu vỏ
tôm, Báo cáo đề tài NCKH cấp trường, Đại học Thủy sản Nha Trang.
2. Hoàng Thị Huệ An (2003), Quan hệ giữa cấu trúc phân tử v à hoạt tính sinh
học của astaxanthin, Tạp chí Khoa học –Công ngệ Thủy sản, số 2/2003.
3. Nguyễn Cảnh (1993), Quy hoạch thực nghiệm, Trường Đại học Bách khoa
TP. Hồ Chí Minh,10-15.
4. Nguyễn Việt Dũng (1999), Nghiên cứu sự biến đổi của tôm sau khi chết v à
phương pháp bảo quản tôm nguyên liệu, Luận án Tiến sĩ kỹ thuật, 45-52.
5. Phan Hiếu Hiền (2001), Phương pháp bố trí thí nghiệm và xử lý số liệu –Nxb
Nông nghiệp, 22-24.
6. Trần Thị Luyến v à c ộng sự (2003), Nghiên c ứu sản xuất Chitosan bằng
enzyme papain, Tạp chí KHCN Thuỷ sản, Đại học Thuỷ sản, số 1, 3-8.
7. Trần Thị Luyến và cộng sự (2003), Nghiên cứu sản xuất Chitosan từ vỏtôm sú
bằng phương pháp hoá h ọc với một công đoạn xử lý kiề m, Tạp chí KHCN
Thuỷ sản, Đại học Thuỷ sản, số 5,18-20.
8. Trần Thị Luyến (2004), Báo cáo tổng kết dự án sản xuất thử ngh iệm cấp bộ
sản xuất Chitin, Chitosan từ ph ế liệu chế biến thuỷ sản, Mã số B2002-33-01-DA, 8-15.
9. Trần Thị Luyến, Đỗ Minh Phụng, N guyễn Anh Tuấn (2004), Sản xuất các chế
phẩm kỹ thuật và y dược từ phế liệu Thuỷ sản –Nxb Nông nghiệp, 10-25.
10. Trần Thị Luyến, (2006), Các phản ứng cơ bản và biến đổi của thực phẩm trong
quá trình công nghệ -Nxb Nông nghiệp, 2-17.
11. Trần Thị Luyến và Đỗ Thị Bích Thủy (2006), Nghiên cứu nuôi cấy trực tiếp vi
khuẩn Bacillus subtilis để loại p rotein ra khỏi phần vỏ của phế liệu tôm, Tạp chí
KHCN Thuỷ sản, Đại học Thuỷ sản, số 2,47-51.
82
12. Nguyễn Văn Ngoạn (1995), Nghiên cứu công nghệ tổng hợp sử dụng phế thải
trong s ản xuất tôm đông lạnh xuất khẩ u, Đ ề tài KN –O4 –17, Vi ện nghiên
cứu Hải sản, Hải Phòng, 8-12.
13. Nguyễn Hữu T ào, Lê Văn Li ễn, Bùi Văn Chính, V ũ Chí C ương (2001), Kỹ
thuật chế biến, bảo quản v à sử dụng nguồn phụ phẩm nông nghiệp và hải sản
làm thức ăn chăn nuôi, Viện Chăn Nuôi, 25-32.
14. Đặng Bửu T ùng Thiện (2005), Nghiên cứ thu hồi astaxanthin v à tái s ử dụng
dịch thải HCl, NaOH trong quá t rình sản xuất chitin-chitosan, Luận án thạc sĩ
kỹ thuật, Trường Đại học Nha Trang.
15. Bùi Văn Tú (2006), Nghiên cứu sử dụng vi khuẩn lactic để tách protein vỏ tôm
trong công ngh ệ sản xuất chitosan , Luận án thạc sĩ kỹ thuật, Tr ường Đại học
Nha Trang.
16. M.T.DenSiKov, Nguyễn Văn Đạt, B ùi Huy Thanh (1997), Tận dụng phế liệu
của côngnghiệp thực phẩm, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, 60-64.
17. Roelof Schoemaker, Chuyên gia tư v ấn (2005), Tận dụng phế liệu tôm, D ự án cải
thiện chất lượng và xuất khẩu Thuỷ sản (Seawip), Nxb Nông nghiệp, 10-15.
TIẾNG NƯỚC NGOÀI
18. Adler –Niesen. J.,(1986), Enzyme Hydrolysis of Food Prote ins, Elsevier
Applied Science Publishers, New York.
19. Asbjorn Gildberg, Even Stenber g., (2000), A new process for advanced
utilisention of shrimp waste, pp. 2-7.
20. Birch. G.G., Blakerough. N., a nd Parker. K.J., (1981), Enzymes and Food
Processing Applied, Science Publishers Ltd, London.
21. Bustos. R.O., and Michael. H., (1994), Microbial deproteinisation of waste
prawn shell, Institution of Chemical Engi neers Symposium Series, Instit ution
of Chemical Engineers, Rugby, England, pp. 13-15.
22. Chen. H, Meyers. S.P., (1982), Axtraction of astaxanthin pigm ent from
crawfish waste using a soy oilprocess, J Food Sci 47, pp. 892-900.
83
23. Chen. H, Meyers. S., (1983), Ensilage treatment of crawfish waste for
improvement of astaxanthin pigment extraction, J Food Sci 48, pp. 55-1516.
24. Chen. HM, Meyers. SP, Hardy. R W, Biede. SL., (1985), Color stability of
astaxanthin pigmented rainbow trout under various packaging conditions, J
Food Sci 49, pp. 40-1337.
25. Dalev. P.G., Simeonova. L.S., (1992), An enzyme biote chnology for thetotal
utilization of leather wastes, Biotechnol Lett Vol. 14, pp.531-534.
26. Domard. A., (1996), Some physicochemical and struc tural basis for
applicability of chitin and ch itosan, The Proceedings of the Secon d Asia
Pacific Symposium, (eds. S tevens, W.F, Rao, M.S and Chan drkrachang, S),
Asian Institute of Technology,BangKok, Thailand, pp. 1-12.
27. Gagne. N. and Simpson. B.K., ( 1993), Use of proteolytic enzymes to facilitate
recovery from shrimp wastes, Food Biotechnol, pp. 253-263.
28. George Britton., (1995), Structure and properties of ca rotenoids in relation of
Funtion, the FASEB journal, pp.1551-1558.
29. Eyonne Wai Yan Tan, Vern Ru Le e., (2001), Enzymatic Hydrolysis of Prawn
Shell Waste for Purification o f Chitin, Departerment of Chemical Eng ineering
Loughborough University, pp. 4-5.
30. Felse. P.A, and Panda. T., (19 90), Studies on applications of chi tin and its
derivatives, Bioprocess Engineering, pp. 505-512.
31. Hall. G. M,. and De Silva. S., (1994), “ Shrimp waste ensilation ” INFOFISH
International, 2/94, pp. 27-30.
32. Holanda and Netto., (2006), Recovery of Components from sh rimp
Xiphopenaeus kroyeri Processin g waste by Enzymatic Hydrolysi s, Journal of
Food Science, Vol.71, pp. 1-6.
33. Kristinsson. HG., Rasco. BA., (2000), Fish protein hydrolysates:
production, biochemical and functional p roperties, Crit Rev Food Sci Nutr
40 (1), pp. 43-81.
34. Lambertsen. G, Braekkan. O.R.,(1971), Method of Analysis of Astaxanthin and
its Occurrence in some Marine Products, J.TIBTECH, pp.99-101.
84
35. Meyers. SP, Bligh. D., (1981), Characterization of astaxanthin p igments from
heat-processed crawfish waste , J Agric Food Chem 29, pp. 8 -505
36. Mizani. M., Aminlari. M., Khod abandeh. M., (2005), An effective method for
producing a nutritive protein extract powder from shrimp -head waste , Foo d
Science and Technology International, Vol.11, No. 1, 49 -54.
37. No. HK, Meyers. SP, Lee. HS., (1989), Isolation and characterizationof chitin
from crawfish shell waste , J Agric Food Chem 37, pp. 9 -575.
38. Sachindra. N.M., and Mahendrak ar. N.S., (2004), Process optimization for
extraction of carotenoids from shimp waste with vegetable oi ls, Bioresource
Technology, pp.1195-1200.
39. Saito. A, Regier. LW., (1971) , Pigmentation of brook trout (S alvelinus
fontinalis) by feeding dried c rustacean waste, J Fish Res 2, pp. 12-509.
40. Shahidi. F, Synowiecki. J., (1 991), Isolation and characterizationof nutrients
and value added products from snow crab (Chinoecetes opilio) and shrimp
(Pandalus borealis), J Agric Food Chem 39, pp. 32 -1527.
41. Shimahara. K, Yasuyuki. T, Kaz uhiro. O , Kazunori. K, Osamu. O., (198 4),
Chemical composition and some properties of crustacean Chiti n prepared by use of
proteolytic activity of Pseudomonas maltophilia LC102. In: Zikakis JP (ed) Chitin,
Chitosan and related enzymes. Academic, Orlando, FL, pp 23 9–255.
42. Shimahara. K, and Takiuchi.Y., (1998), Methods in Enzymology, Academic Pres,
New York 161, pp. 417 - 423.
43. Synowiecki and Al -Khateeb., (2000), The recovery of protein hydrol ysate
during enzymatic isolation of Chitin from shrimp Crangon crangonprocessing
discards, pp. 147-152.
44. Synowiecki and Al -Khateeb., (2001), Production, Properties, and So me New
Applications of Chitin and ItsDerivatives, Department of Food Chemistry a nd
Technology, Poland, pp. 154-156.
45. Rebeca. B, Pena –Vera. MT, Diaz -Castaneda. M., (1991), Production of fish
protein hydrolysates with bact erial proteases yield and nutr itional value , J
Food Sci 56, pp. 14-309.