Chuyên Đề Nghiên cứu sự biểu hiện của gen quy định protein vỏ của Rice grassy stunt virus và rice ragged stunt

Đề tài: Nghiên cứu sự biểu hiện của gen quy định protein vỏ của Rice grassy stunt virus và rice ragged stunt virus



MỤC LỤC

Lời cảm ơn. i

Mục lục. ii

Danh mục từ viết tắt. v

Danh mục bảng. vi

Danh mục hình. vii

Tóm tắt viii

PHẦN I. MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề. 1

1.2. Mục đích. 2

1.3. Yêu cầu. 2

PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1. Giới thiệu chung về rice ragged stunt virus. 3

2.1.1. Thông tin chung về rice ragged stunt virus. 3

2.1.2. Cấu trúc thể virus. 3

2.1.3. Đặc điểm bộ gen virus. 4

2.1.4. Huyết thanh học. 6

2.2. Giới thiệu chung về virus Rice grassy stunt virus . 7

2.2.1. Thông tin chung về Rice ragged stunt virus. 7

2.2.2. Cấu trúc thể virus. 7

2.2.3. Tổ chức bộ gen virus. 8

2.2.4. Huyết thanh học. 11

2.3. Phương thức lây truyền và phương hướng phòng trừ bệnh vàng lùn, lùn xoắn lá. 12

2.3.1. Phương thức lây truyền của bệnh. 12

2.3.2. Phương hướng phòng trừ bệnh vàng lùn, lùn xoắn lá. 13

2.4. Tầm quan trọng kinh tế của bệnh vàng lùn, lùn xoắn lá. 14

2.4.1. Trên thế giới. 14

2.4.2. Ở Việt Nam. 16

2.5. Các hệ thống biểu hiện gen. 16

2.5.1. Khái niệm và phân loại. 16

2.5.2. Hệ thống biều hiện gen ở sinh vật nhân sơ (vi khuẩn). 16

2.5.3. Hệ thống tế bào chủ nhân chuẩn. 17

PHẦN III. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. 19

3.1. Đối tượng nghiên cứu. 19

3.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu. 19

3.3. Vật liệu nghiên cứu. 19

3.4. Nội dung và phương pháp nghiên cứu. 19

3.4.1. Clone gen P9 và pC5 vào vector cloning pGEM –T-esay. Transform vào chủng vi khuẩn clone JM109. 19

3.4.2. Biến nạp cấu trúc biểu hiện vào dòng vi khuẩn biểu hiện BL21 (DE3). 22

3.4.3. Cảm ứng biểu hiện gen P9 (RRSV) và pC5 (RGSV). 23

3.4.4. Phân tích SDS-PAGE kiểm tra hiệu quả cảm ứng biểu hiện gen. 24

3.4.5. Tinh chiết protein biểu hiện của gen P9 (RRSV) và pC5 (RGSV). 25

3.3.6. Tiêm thỏ. 25

3.4.7. Tinh chiết kháng thể. 26

PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. 27

4.1. Xây dựng cấu trúc biểu hiện gen p9 (RRSV) và pC5 (RGSV) 27

4.1. 1. Lựa chọn vùng gen. 27

4.1.2. Phân lập gen P9 và pC5 bằng RT-PCR 28

4.1.3. Dòng hóa gen P9 và gen pC5 bằng vector nhân dòng pGEM-T-Easy. 29

4.1.4. Dòng hóa gen pC5 và gen P9 bằng vector biểu hiện pET28a và chủng E. coli BL21(DE3) 31

4.2. Biểu hiện protein pC5 và p9 tái tổ hợp. 35

4.2.1. Biểu hiện protein pC5 và p9 tái tổ hợp bằng IPTG 35

4.2.2. Biểu hiện protein pC5 và p9 tái tổ hợp bằng phương pháp tự cảm ứng. 39

4.3. Thử nghiệm tạo kháng thể thỏ đặc hiêu protein tái tổ hợp p9. 41

4.3.1. Cảm ứng, tinh chiết và gây miễn dịch p9 tái tổ hợp trên thỏ. 41

4.3.1. Kiểm tra sự có mặt của kháng thể thỏ đặc hiệu p9 bằng ELISA gián tiếp. 43

4.3.2. Tinh chiết kháng thể và kiểm tra kháng thể bằng ELISA trực tiếp (DAS-ELISA) 44

PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 47

5.1 Kết luận. 47

5.2. Đề nghị 48