Thạc Sĩ Nghiên cứu sự biến đổi di truyền các gen PB2, PB1 và PA polymerase của virus cúm A/H5N1 đương nhiễm

Luận án tiến sĩ năm 2014
Đề tài: Nghiên cứu sự biến đổi di truyền các gen PB2, PB1 và PA polymerase của virus cúm A/H5N1 đương nhiễm tại Việt Nam


MỤC LỤC

Trang
Trang phụ bìa
Lời cảm ơn
Lời cam đoan
Mục lục i
Danh mục chữ viết tắt trong luận án iv
Danh mục các bảng v
Danh mục các hình và sơ đồ vii
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chương 1. TỔNG QUAN 3
1.1. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VIRUS CÚM A 3
1.1.1. Cấu tạo chung của virus cúm A 3
1.1.2. Đặc điểm cấu tạo hệ gen của virus cúm A 4
1.1.3. Cấu tạo và chức năng của các phân đoạn RNA hệ gen virus cúm A 5
1.1.4. Đặc điểm cấu tạo và chức năng của các gen PB2, PB1 và PA 7
1.1.5. Phức hợp enzym polymerase của virus cúm A 12
1.1.6. Đặc tính biến đổi di truyền các gen và hệ gen virus cúm A 14
1.2. ĐẠI DỊCH CÚM A VÀ ĐẶC ĐIỂM BIẾN ĐỔI CÁC GEN PB2, PB1 VÀ PA CỦA VIRUS CÚM A GÂY ĐẠI DỊCH CÚM Ở NGƯỜI
16
1.2.1. Các đại dịch cúm A ở người trong lịch sử 16
1.2.2. Đặc điểm biến đổi các gen PB2, PB1 và PA của virus cúm A gây đại dịch cúm ở người
17
1. 3. ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ VÀ SINH HỌC VIRUS CÚM A/H5N1 22
1.3.1. Đặc điểm dịch tễ virus cúm A/H5N1 22
1.3.2. Đặc điểm sinh học của virus cúm A/H5N1 26
1.4. NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI CÁC GEN PB2, PB1, PA LIÊN QUAN ĐỘC LỰC VÀ LÂY TRUYỀN Ở NGƯỜI CỦA VIRUS CÚM A/H5N1
28
1.4.1. Trên thế giới 28
1.4.2. Tại Việt Nam 30
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33
2.1. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ TRANG THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 33
2.1.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu 33
2.1.2. Dụng cụ, trang thiết bị 35
2.1.3. Các bộ kit sinh học phân tử sử dụng trong nghiên cứu 36
2.1.4. Môi trường sử dụng trong dòng hóa 36
2.1.5. Các hóa chất sử dụng trong điện di trên gel agarose 36
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37
2.2.1. Kỹ thuật tách chiết ribonucleic acid tổng số 38
2.2.2. Thiết kế các trình tự mồi nucleotide sử dụng trong nghiên cứu 38
2.2.3. Kỹ thuật RT-PCR 41
2.2.4. Tinh sạch DNA sản phẩm PCR 44
2.2.5. Kỹ thuật điện di nucleic acid trên gel agarose 45
2.2.6. Kỹ thuật dòng hóa DNA 45
2.2.7. Giải trình tự DNA 48
2.2.8. Xử lí, kiểm chứng, thu nhận trình tự nucleotide và amino acid của các gen nghiên cứu
50
2.3. VẤN ĐỀ ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU 52
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 53
3.1. KẾT QUẢ THU NHẬN VÀ GIẢI TRÌNH TỰ CÁC GEN PB2, PB1 VÀ PA CỦA SÁU BIẾN CHỦNG VIRUS CÚM A/H5N1 NGHIÊN CỨU
53
3.1.1. Kết quả tách chiết RNA tổng số và chuyển đổi cDNA hệ gen virus 53
3.1.2. Kết quả PCR thu nhận và dòng hóa DNA các gen PB2, PB1 và PA 54
3.1.3. Kết quả giải trình tự DNA các gen PB2, PB1 và PA 60
3.2. KẾT QUẢ SO SÁNH THÀNH PHẦN NUCLEOTIDE VÀ AMINO ACID CÁC GEN PB2, PB1 VÀ PA CỦA SÁU BIẾN CHỦNG VIRUS CÚM A/H5N1 NGHIÊN CỨU VỚI CÁC CHỦNG THẾ GIỚI

61
3.2.1. Kết quả so sánh thành phần nucleotide và amino acid gen PB2 61
3.2.1.1 Kết quả so sánh thành phần nucleotide và amino acid gen PB2 61
3.2.1.2 Kết quả so sánh tỉ lệ tương đồng về nucleotide và amino acid gen PB2 65
3.2.2. Kết quả so sánh thành phần nucleotide và amino acid gen PB1 67
3.2.2.1 Kết quả so sánh thành phần nucleotide và amino acid gen PB1 67
3.2.2.2 Kết quả so sánh tỉ lệ tương đồng về nucleotide và amino acid gen PB1 69
3.2.2.3 Kết quả so sánh thành phần nucleotide và amino acid gen PB1-F2 69
3.2.2.4 Kết quả xác định trình tự khung đọc mở gen PB1-N40 73
3.2.3. Kết quả so sánh thành phần nucleotide và amino acid gen PA 73
3.2.3.1 Kết quả so sánh thành phần nucleotide và amino acid gen PA 73
3.2.3.2 Kết quả so sánh tỉ lệ tương đồng về nucleotide và amino acid gen PA 77
3.3. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH PHẢ HỆ NGUỒN GỐC CÁC GEN PB2, PB1 VÀ PA CỦA SÁU BIẾN CHỦNG VIRUS CÚM A/H5N1 NGHIÊN CỨU
79
3.3.1. Kết quả phân tích xác định phả hệ nguồn gốc gen PB2 79
3.3.2. Kết quả phân tích xác định phả hệ nguồn gốc gen PB1 82
3.3.3. Kết quả phân tích xác định phả hệ nguồn gốc gen PA 85
Chương 4. BÀN LUẬN 88
4.1. VỀ KẾT QUẢ THU NHẬN CÁC GEN PB2, PB1 VÀ PA CỦA SÁU BIẾN CHỦNG VIRUS CÚM A/H5N1 NGHIÊN CỨU
88
4.1.1. Về kết quả thu nhận các gen PB2, PB1 và PA 88
4.1.2. Về qui trình nghiên cứu thu nhận các gen PB2, PB1 và PA 88
4.2. VỀ KẾT QUẢ SO SÁNH THÀNH PHẦN NUCLEOTIDE VÀ AMINO ACID CÁC GEN PB2, PB1, PA CỦA SÁU BIẾN CHỦNG VIRUS CÚM A/H5N1 NGHIÊN CỨU VỚI CÁC CHỦNG CỦA THẾ GIỚI

89
4.2.1. Về biến đổi thành phần nucleotide và amino acid gen PB2 89
4.2.2. Về biến đổi thành phần nucleotide và amino acid gen PB1 93
4.2.2.1 Về kết quả so sánh thành phần nucleotide và amino acid gen PB1 93
4.2.2.2 Về biến đổi thành phần nucleotide và amino acid gen PB1-F2 94
4.2.2.3 Về kết quả xác định trình tự khung đọc mở gen PB1-N40 96
4.2.3. Về biến đổi thành phần nucleotide và amino acid gen PA 97
4.3. VỀ KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH PHẢ HỆ NGUỒN GỐC CÁC GEN PB2, PB1, CỦA SÁU BIẾN CHỦNG VIRUS CÚM A/H5N1 NGHIÊN CỨU VỚI CÁC CHỦNG CỦA THẾ GIỚI

99
4.3.1. Về kết quả xác định phả hệ nguồn gốc gen PB2 99
4.3.2. Về kết quả xác định phả hệ nguồn gốc gen PB1 102
4.3.3. Về kết quả xác định phả hệ nguồn gốc gen PA 103
4.4. PHÂN TÍCH BIẾN ĐỔI PHỨC HỢP ENZYM POLYMERASE, TỔ HỢP CÁC GEN PB2, PB1 VÀ PA CỦA SÁU BIẾN CHỦNG VIRUS CÚM A/H5N1 NGHIÊN CỨU VỚI CÁC CHỦNG CỦA THẾ GIỚI

105
4.3.1. Về đặc điểm biến đổi phức hợp enzym polymerase liên quan bệnh học và dịch tễ học lây truyền sang người của virus cúm A/H5N1
105
4.3.2. Về nguồn gốc tổ hợp các gen PB2, PB1 và PA polymerase 108
KẾT LUẬN
114
KIẾN NGHỊ 116


ĐẶT VẤN ĐỀ
Virus cúm A thuộc họ Orthomyxoviridae, gồm nhiều phân type (subtype) lưu hành ở chim hoang dã, có khả năng biến đổi xâm nhiễm, lây truyền sang người và nhiều loài động vật, nguyên nhân gây ra các đại dịch cúm A ở người trong lịch sử.
Hệ gen của virus cúm A là ribonucleic acid (RNA) sợi đơn âm, gồm 8 phân đoạn RNA riêng biệt là PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M và NS, lần lượt mã hóa tổng hợp 12 protein tương ứng được biết cho đến nay, đó là PB2, PB1, PB1-N40, PB1-F2, PA, HA, NP, NA, M1, M2, NS1 và NS2. Các protein trên tham gia cấu tạo hạt virus và đảm bảo các chức năng xâm nhiễm, độc lực và thích nghi lây truyền gây bệnh của virus ở các loài vật chủ. Đặc biệt, phức hợp enzym polymerase của virus cúm A không có cơ chế “đọc-sửa” bản sao trong quá trình sao chép, tổng hợp các phân đoạn RNA hệ gen của hạt virus mới. Đặc tính cấu trúc hệ gen và enzym polymerase giúp virus cúm A có khả năng đột biến cao, hình thành chủng virus mới thay đổi độc lực hoặc chuyển nhiễm, thích nghi lây truyền sang nhiều loài vật chủ và người trong quá trình lưu hành tự nhiên. Trong đó, các gen PB2, PB1 và PA mã hóa tổng hợp 3 protein PB2, PB1 và PA polymerase, là các đơn vị cấu tạo phức hợp enzym polymerase, có vai trò quyết định khả năng thích nghi nhân lên và lây truyền của virus ở cơ thể các loài vật chủ. Ngoài ra, gen PB1 còn chứa 2 khung đọc mở gen PB1-F2 và PB1-N40 mã hóa tổng hợp các protein tương ứng, tham gia biểu hiện độc lực của virus cúm A ở cơ thể bị nhiễm.
Từ năm 2003 đến nay, virus cúm A/H5N1 thể độc lực cao nguyên nhân gây ra dịch cúm gia cầm và gây bệnh có tỉ lệ tử vong cao ở người (khoảng 60%), lan truyền rộng rãi tới hơn 60 quốc gia trên thế giới. Trong đó, Việt Nam là quốc gia có dịch cúm gia cầm A/H5N1 bùng phát vào năm 2003 và liên tục tái bùng phát nhiều đợt dịch ở gia cầm hàng năm tại các địa phương, với hơn 62 người tử vong trong tổng số hơn 124 người được xác định nhiễm loại virus này. Các trường hợp người nhiễm và tử vong bởi virus cúm A/H5N1, được xác định là do virus xâm nhiễm trực tiếp sang người thông qua tiếp xúc với gia cầm bệnh, chất thải ô nhiễm hoặc do sử dụng các sản phẩm chứa virus từ gia cầm bệnh. Việt Nam cùng với Indonesia và Hy Lạp, là các quốc gia có tỉ lệ người nhiễm và tử vong do virus cúm A/H5N1 cao nhất trên thế giới, được xác định là vùng dịch tễ trọng điểm cần quan tâm giám sát, ngăn chặn, khống chế sự lây truyền của virus ở gia cầm và từ gia cầm sang người.
Các chủng virus cúm A/H5N1 clade 1, 2 và 7 với sự hình thành nhiều nhánh clade thuộc 3 genotye Z, V và G, là các nhóm virus lưu hành phổ biến gây dịch cúm A/H5N1 ở chim hoang dã, gia cầm và xâm nhiễm gây bệnh với tỉ lệ tử vong cao ở người, tại Việt Nam và nhiều quốc gia trên thế giới từ năm 2003 đến nay. Gần đây, nhóm virus clade 1.1 và đặc biệt là nhóm virus clade 2.3.2.1 hình thành từ năm 2009, có sự thay đổi lớn về kháng nguyên H5, có độc lực cao ở gia cầm và người nhiễm so với các nhóm virus lưu hành trước đó, làm cho vấn đề phòng chống dịch cho gia cầm và ngăn ngừa virus xâm nhiễm ở người trở nên phức tạp hơn.
Sự biến đổi của các gen PB2, PB1 và PA là cơ sở giúp virus thích nghi nhân lên trong tế bào cảm thụ, yếu tố chìa khóa quyết định quá trình lây truyền dễ dàng giữa người với người và gia tăng độc lực của virus ở cơ thể người, một trong các vấn đề được quan tâm nghiên cứu giám sát ở virus cúm A/H5N1 gây bệnh dịch ở gia cầm và người hiện nay. Bên cạnh đó, dữ liệu di truyền của các gen PB2, PB1 và PA cùng với các gen trong hệ gen virus cúm A/H5N1 đương nhiễm, là cơ sở khoa học cho phép dự báo sớm diễn biến dịch tễ học virus ở mức độ phân tử, nghiên cứu phát triển vaccine tái tổ hợp và sử dụng vaccine phòng chống bệnh cúm A/H5N1 cho người và gia cầm trong tương lai.
Xuất phát từ cơ sở lí luận và thực tế trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu sự biến đổi di truyền các gen PB2, PB1 và PA polymerase của virus cúm A/H5N1 đương nhiễm tại Việt Nam”.
Nhằm các mục tiêu:
1- Giải trình tự, so sánh biến đổi đặc tính di truyền, tương đồng về nucleotide và amino acid các gen PB2, PB1, PA, của một số biến chủng virus cúm A/H5N1 đương nhiễm tại Việt Nam từ năm 2007 – 2011 với các chủng A/H5N1 trên thế giới.
2- Tìm hiểu nguồn gốc phả hệ các gen nói trên của các biến chủng virus cúm A/H5N1 trong nghiên cứu với các chủng virus A/H5N1 của Việt Nam và thế giới.



TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Murphy BR and Webster RG (1996), Orthomyxoviruses. In “Fields B.N., Knipe D.M., Howley P.M.” (eds.). Fields Virology (3rd ed.), pp. 1397-1445.
2. Nicholson KG, Wood JM and Zambon M (2003), “Influenza”, Lancet, 362, pp. 1733-1745.
3. Lee CW and Saif YM (2009), “Avian influenza virus”, Comp Immun Microbiol Infect Dis, 32, pp. 301–310.
4. Cox NJ and Subbarao K (2000), “Global epidemilogy of influenza: Past and Present”, Annu Rev Med, 51, pp. 407–421.
5. Lê Thanh Hòa, Trương Nam Hải, Nông Văn Hải, Đinh Duy Kháng, Phan Văn Chi, Quyền Đình Thi, Lê Trần Bình (2009), “Nguồn gen và cơ chế tiến hóa phân tử của virus cúm A/H1N1-2009 gây đại dịch ở người hiện nay”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 7(2), tr. 133-153.
6. Alexander DJ (2007), “An overview of the epidemiology of avian influenza”. Vaccine, 25, pp. 5637–5644.
7. Hilleman MR[FONT=Segoe UI] (2002), “Realities and enigmas of human viral influenza: pathogenesis, epidemiology and control”, Vaccine, 20 (25-26), pp. 3068-3087.[/FONT]
[FONT=Segoe UI]8. [/FONT][B]Lê Thanh Hòa[FONT=Segoe UI] (2006), [/FONT][I]Y-sinh học phân tử. Nhà xuất bản Y học, tập 1, 240 trang.
9. [B]Chen W, Calvo PA, Malide D, Gibbs J, Schubert U, Bacik I, Basta S, O'Neill R, Schickli J, Palese P, Henklein P, Bennink JR, Yewdell J[FONT=Segoe UI] (2001), “A novel influenza A virus mitochondrial protein that induces cell death”, [/FONT][I]Nature Medicine, 7, pp. 1306-1312.
10. [B]Parrish CR and Kawaoka Y[FONT=Segoe UI] (2005), “The origins of new pandemic viruses: The acquisition of new host ranges by canine parvovirus and influenza A viruses”, [/FONT][I]Annu Rev Microbiol, 59, pp. 553-586.
11. [B]Wise HM, Foeglein A, Sun J, Dalton RM, Patel S, Howard W, Anderson EC, Barclay WS and Digard P[FONT=Segoe UI] (2009), “A complicated message: Identification of a novel PB1-related protein translated from influenza A virus segment 2 mRNA”, [/FONT][I]J Virol, 83(16), pp. 8021–8031.
12. [B]Peiris JSM, de Jong MD. and Guan Y[FONT=Segoe UI] (2007), “Avian influenza virus (H5N1): A threat to human health, Clinical Microbiology, Reviews”, [/FONT][I]American Society for Microbiology, 20(2), pp. 243–267.
13. [B]Gabriel G, Dauber B, Wolff T, Planz O, Klenk HD, Stech J[FONT=Segoe UI] (2005), “The viral polymerase mediates adaptation of an avian influenza virus to a mammalian host”,[/FONT][I]Proc Natl Acad Sci [I]USA, 102, pp. 18590-18595.
14. [B]He X, Zhou J, Bartlam M, Zhang R, Ma J, Lou Z, Li X, Li J, Joachimiak A, Zeng Z, Ge R, Rao Z. and Liu Y[FONT=Segoe UI] (2008), “Crystal structure of the polymerase PA[/FONT][SUB]C[/SUB][FONT=Segoe UI]–PB1[/FONT][SUB]N[/SUB][FONT=Segoe UI] complex from an avian influenza H5N1 virus”, [/FONT][I]Nature, 454, pp. 1123 – 1126.
15. [B]Reuther P, Mänz B, Brunotte L, Schwemmle M, Wunderlich K[FONT=Segoe UI] (2011), “Targeting of the influenza A virus polymerase PB1-PB2 interface indicates strain-specific assembly differences”, [/FONT][I]J Virol, 85(24), pp. 13298-309.
16. [B]Gabriel G, Herwig A, Klenk HD[FONT=Segoe UI] (2008), “Interaction of polymerase subunit PB2 and NP with importin alpha 1 is a determinant of host range of influenza A virus”,[/FONT][I]PLoS Pathog, 4(2), pp.11-13.
17. [B]Hudjetz B and Gabriel G[FONT=Segoe UI] (2012), “Human-like PB2 627K influenza virus polymerase activity is regulated by importin-α1 and -α7” [/FONT][I]PLoS Pathog, 8(1): e1002488.
18. [B]Boivin S and Hart DJ[FONT=Segoe UI] (2011), “Interaction of the influenza A virus polymerase PB2 C-terminal region with importin alpha isoforms provides insights into host adaptation and polymerase assembly”, [/FONT][I]J Biol Chem, 286(12), pp. 10439-48.
19. [B]Labadie K, Afonso SED, Rameix WMA, Werf S, Naffakh N[FONT=Segoe UI] (2007), “Host-range determinants on the PB2 protein of influenza A viruses control the interaction between the viral polymerase and nucleoprotein in human cells”, [/FONT][I]Virology, 362, pp. 271–282.
20. [B]Tada T, Suzuki K, Sakurai Y, Kubo M, Okada H, Itoh T, Tsukamoto K[FONT=Segoe UI] (2011), “NP body domain and PB2 contribute to increased virulence of H5N1 highly pathogenic avian influenza viruses in chickens”, [/FONT][I]J Virol, 85(4), pp. 1834-1846.[/I][/B][/I][/B][/I][/B][/I][/B][/I][/B][/I][/B][/I][/B][/I][/I][/B][/I][/B][/I][/B][/I][/B][/I][/B][/I][/B]