Thạc Sĩ Nghiên cứu sinh tổng hợp nano bạc bằng sinh khối vi khuẩn B.subtilis và B.licheniformis

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Chuyên ngành: Vi sinh vật học
2010

MỤC LỤC

Mục lục i
Danh mục các chữ viết tắt .vi
Danh mục các bảng .vii
Danh mục các hình vẽ .ix
Danh mục các đồ thị .xi
MỞ ĐẦU .1
Chương 1- TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1.Tình hình nghiên cứu sinh tổng hợp nano bạc trong nước và trên thế giới
1.2.Vật liệu nano 5
1.2.1.Phân loại vật liệu nano .5
1.2.2.Hạt nano kim loại .6
1.2.3.Hạt nano bạc .7
1.2.4.Các ứng dụng của nano bạc 10
1.2.4.1.Trong y học 10
1.2.4.2.Trong công nghiệp 1
1.2.4.3.Trong nông nghiệp .12
1.2.4.4.Trong công nghệ xử lý nước .12
1.3.Các phương pháp chế tạo hạt nano bạc 13
1.3.1.Phương pháp ăn mòn laser .13
1.3.2.Phương pháp khử hóa học 13
1.3.3.Phương pháp khử vật lý 14
1.3.4.Phương pháp khử hóa lý .14
1.3.5.Phương pháp khử sinh học .15
1.4.Sơ lược về Bacillus licheniformis 17
1.4.1.Phân loại khoa học vi khuẩn B.licheniformis 17
1.4.2.Đặc điểm hình thái, sinh hóa 18
1.4.3.Đặc điểm nuôi cấy 18
1.4.4.Sinh tổng hợp nano bạc bởi B.licheniformis .19
1.5.Sơ lược về Bacillus subtilis .19
1.5.1.Phân loại khoa học vi khuẩn B.subtilis 19
1.5.2.Đặc điểm hình thái, sinh hóa 20
1.5.3.Đặc điểm nuôi cấy 20
1.5.4.Sự tạo thành bào tử .21
1.5.5.Sinh tổng hợp nano bạc bởi B.subtilis 21
1.6.Phương pháp xác định tính chất và kích thước hạt nano bạc .21
1.6.1.Phương pháp phổ tử ngoại khả kiến – UV-ViS 22
1.6.2.Phương pháp kính hiển vi điện tử truyền qua - TEM 23
1.6.2.Phương pháp nhiễu xạ tia X-XRD 24

Chương 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 25
2.1.Vật liệu .26
2.1.1.Chủng vi sinh vật 26
2.1.2.Dụng cụ và thiết bị 26
2.1.3.Hóa chất .26
2.2.Phương pháp tiến hành .28
2.2.1.Khảo sát khả năng tăng trưởng của B.licheniformis và B.subtilis 28
2.2.1.1.Dựng đường tương quan tuyến tính giữa mật độ quang
OD (độ đục) và mật độ vi khuẩn (CFU/ml) .28
2.2.1.2.Dựng đường cong tăng trưởng 29
2.2.2.Khảo sát quá trình sinh tổng hợp nano bạc .30
2.2.2.1.Khảo sát hàm lượng sinh khối vi khuẩn thích hợp 30
2.2.2.2.Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ AgNO đến quá trình
sinh tổng hợp nano bạc .31
2.2.2.3.Khảo sát thời gian sinh tổng hợp nano bạc .32
2.2.3.Phân tích giản đồ nhiễu xạ tia X (XRD) .33
2.2.4.Phân tích kích thước và hình dạng hạt nano bạc tạo thành .33
2.2.5.Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của dung dịch nano bạc .33
2.2.6.Khảo sát độ bền của dung dịch nano bạc tạo thành 35
2.2.7.Chế tạo vải kháng khuẩn nonwoven .35

Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 36
3.1.Khảo sát khả năng tăng trưởng của B.licheniformis và B.subtilis 37
3.1.1. Đường tương quan tuyến tính giữa mật độ quang OD và mật độ
vi khuẩn (CFU/ml) 37
3.1.2.Xây dựng đường cong tăng trưởng của B.subtilis và
B.licheniformis 39
3.1.2.1.Xây dựng đường cong tăng trưởng của B.subtilis .39
3.1.2.2.Xây dựng đường cong tăng trưởng B.licheniformis 40
3.2.Khảo sát quá trình sinh tổng hợp nano bạc 41
3.2.1.Khảo sát lượng sinh khối vi khuẩn thích hợp .41
3.2.1.1.Khảo sát lượng sinh khối B.subtilis thích hợp 41
3.2.1.2.Khảo sát lượng sinh khối B.licheniformis thích hợp .43
3.2.2.Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ AgNO đến quá trình sinh
tổng hợp nano bạc .44
3.2.2.1.Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ AgNO đến quá trình
sinh tổng hợp nano bạc của B.subtilis 44
3.2.2.2.Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ AgNO đến quá trình
sinh tổng hợp nano bạc của B.licheniformis .47
3.2.3.Khảo sát thời gian sinh tổng hợp nano bạc .49
3.2.3.1.Khảo sát thời gian sinh tổng hợp nano bạc của vi khuẩn
B.subtilis .49
3.2.3.2.Khảo sát thời gian sinh tổng hợp nano bạc của vi khuẩn
B.licheniformis .51
3.3.Kết quả phân tích XRD .52
3.3.1.Mẫu nano bạc tổng hợp bởi B.subtilis .52
3.3.2.Mẫu nano bạc tổng hợp bởi B.licheniformis .53
3.4.Kết quả phân tích kích thước và hình dạng của hạt nano bạc tạo thành .54
3.4.1.Mẫu nano bạc tổng hợp bởi B.subtilis .54
3.4.2.Mẫu nano bạc tổng hợp bởi B.licheniformis .55
3.5.Khảo sát khả năng kháng khuẩn của dung dịch keo nano bạc .56
3.5.1.Khả năng kháng khuẩn của dung dịch keo nano bạc tổng hợp
bởi B.subtilis .56
3.5.2.Khả năng kháng khuẩn của dung dịch keo nano bạc tổng hợp
bởi B.licheniformis .57
3.6.Khảo sát độ bền của dung dịch nano bạc tổng hợp được .59
3.6.1.Dung dịch nano bạc tổng hợp bởi B.subtilis .59
3.6.2.Dung dịch nano bạc tổng hợp bởi B.licheniformis 60
3.7.Kết quả chế tạo vải kháng khuẩn non-woven 61
3.8.So sánh quá trình sinh tổng hợp nano bạc giữa B.subtilis và
B.licheniformis 63

Chương 4 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 65
4.1.Kết luận 66
4.2.Kiến nghị 67

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ 68
TÀI LIỆU THAM KHẢO .69
PHỤ LỤC 74

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1.Mật độ B.subtilis trong các dung dịch nuôi cấy có giá trị OD
khác nhau 37
Bảng 3.2.Mật độ B.licheniformis trong các dung dịch nuôi cấy có giá trị OD
khác nhau 38
Bảng 3.3.Vị trí đỉnh hấp thu và OD của các dung dịch nano bạc ứng với lượng
sinh khối vi khuẩn B.subtilis khác nhau 42
Bảng 3.4.Vị trí đỉnh hấp thu và OD của các dung dịch nano bạc ứng với lượng
sinh khối vi khuẩn B.licheniformis khác nhau .43
Bảng 3.5.Vị trí đỉnh hấp thu và OD của các dung dịch nano bạc tổng hợp bởi
B.subtilis tại các nồng độ AgNO khác nhau .45
Bảng 3.6.Mật độ vi khuẩn sống trong dung dịch AgNO - sinh khối
B.subtilis với các nồng độ AgNO khác nhau 45
Bảng 3.7.Vị trí đỉnh hấp thu và OD của các dung dịch nano bạc tổng hợp bởi
B.licheniformis ở các nồng độ AgNO khác nhau .47
Bảng 3.8.Mật độ vi khuẩn sống trong dung dịch AgNO - sinh khối
B.licheniformis với các nồng độ AgNO khác nhau 48
Bảng 3.9.Vị trí đỉnh hấp thu và OD của các dung dịch nano bạc tổng hợp
bởi B.subtilis theo thời gian .50
Bảng 3.10.Vị trí đỉnh hấp thu và OD của các dung dịch nano bạc tổng hợp
bởi B.licheniformis theo thời gian 52
Bảng 3.11.Hiệu lực kháng khuẩn của các dung dịch nano bạc được tổng hợp
bởi B.subtilis .56
Bảng 3.12.Hiệu lực kháng khuẩn của các dung dịch nano bạc được tổng hợp
bởi B.licheniformis 58
Bảng 3.13.Hiệu lực kháng khuẩn của vải non-woven tẩm nano bạc trước và sau khi
giặt 62


DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1.Cơ chế diệt khuẩn của bạc 8
Hình 1.2.Sản phẩm khăn và băng gạc có chứa nano bạc .10
Hình 1.3.Một số ứng dụng của nano bạc trong công nghiệp .11
Hình 1.4. Sản phẩm thuốc trừ bệnh MIFUM có chứa nano bạc 12
Hình 1.5.Thiết bị xử lý nước uống nhiễm khuẩn với cột lọc Polyurethane
xốp tẩm nano bạc 13
Hình 1.6.Cơ chế giả thuyết của quá trình sinh tổng hợp nano bạc .16
Hình 1.7.Vi khuẩn B.licheniformis 18
Hình 1.8.Cơ chế tổng hợp nano bạc ở vi khuẩn B.licheniformis .19
Hình 1.9.Vi khuẩn B.subtilis .20
Hình1.10.Máy đo UV-Vis Cary – 100 .22
Hình 1.11.Hệ thống hiển vi điện tử truyền qua JEM-1400 23
Hình 1.12.Máy XRD D8 Advance 24
Hình 3.1.Phổ UV-Vis của các dung dịch nano bạc ứng với lượng sinh khối
vi khuẩn B. subtilis khác nhau .42
Hình 3.2.Phổ UV-Vis của các dung dịch nano bạc ứng với lượng sinh khối
vi khuẩn B. licheniformis khác nhau .43
Hình 3.3.Phổ UV-Vis các dung dịch nano bạc ứng với các nồng độ AgNO
khác nhau (B.subtilis) 44
Hình 3.4.Phổ UV-Vis các dung dịch nano bạc ứng với các nồng độ AgNO
khác nhau (B.licheniformis) 47
Hình 3.5.Phổ UV-Vis các mẫu dung dịch theo thời gian phản ứng
sinh tổng hợp (B.subtilis) 50
Hình 3.6.Phổ UV-Vis các mẫu dung dịch theo thời gian phản ứng
sinh tổng hợp (B.licheniformis) .51
Hình 3.7.Kết quả XRD của nano bạc tổng hợp bởi B.subtilis 53
Hình 3.8.Kết quả XRD của nano bạc tổng hợp bởi B.licheniformis 54
Hình 3.9.Ảnh TEM và sự phân bố kích thước hạt trong mẫu dung dịch BS3B .54
Hình 3.10.Ảnh TEM và sự phân bố kích thước hạt trong mẫu dung dịch BL3D .55
Hình 3.11.Hoạt tính kháng khuẩn của các dung dịch nano bạc tổng hợp
nhờ B.subtilis .56
Hình 3.12.Hoạt tính kháng khuẩn của các dung dịch nano bạc tổng hợp
nhờ B.licheniformis .58
Hình 3.13.Độ bền của dung dịch nano bạc tổng hợp bởi B.subtilis .59
Hình 3.14.Độ bền của dung dịch nano bạc tổng hợp bởi B.licheniformis 60
Hình 3.15.Vải non-woven trước và sau khi ngâm tẩm nano bạc .61
Hình 3.16.Ảnh FE-SEM của mẫu vải non-woven trước và sau khi ngâm tẩm
nano bạc 62
Hình 3.17.Hiệu lực kháng khuẩn của vải non-woven tẩm nano bạc trước và
sau 5, 10, 15 lần giặt 63

DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ

Đồ thị 3.1.Đường chuẩn OD và mật độ vi khuẩn B.subtilis .38
Đồ thị 3.2.Đường chuẩn OD và mật độ vi khuẩn B.licheniformis .39
Đồ thị 3.3 Đường cong tăng trưởng của vi khuẩn B. subtilis .39
Đồ thị 3.4.Đường cong tăng trưởng của vi khuẩn B. licheniformis .40
Đồ thị 3.5.Mật độ vi khuẩn sống trong dung dịch AgNO - sinh khối
B. subtilis với các nồng độ AgNO khác nhau .46
Đồ thị 3.6.Mật độ vi khuẩn sống trong dung dịch AgNO - sinh khối
B. licheniformis với các nồng độ AgNO khác nhau .48
Đồ thị 3.7.Hiệu lực kháng E. coli của các dung dịch nano bạc tổng hợp
bởi B.subtilis .57
Đồ thị 3.8.Hiệu lực kháng E. coli của các dung dịch nano bạc tổng hợp
bởi B.licheniformis 58

MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây, khoa học và công nghệ nano đã phát triển như vũ bão. Các vật liệu nano với những đặc tính kì lạ, đặc biệt về quang, điện, từ, sinh học đã và đang thâm nhập vào toàn bộ lĩnh vực trong đời sống và kinh tế của thế giới. Với kích thước nano các loại vật liệu này có thể can thiệp đến từng phân tử -nguyên tử, điều này đặc biệt quan trọng trong ứng dụng Y-sinh học.

Trong lĩnh vực Công nghệ nano, công nghệ nano bạc đóng vai trò khá quan trọng. Bạc ở kích thước nano là một kháng sinh tự nhiên và rất mạnh, có khả năng phòng ngừa nhiều bệnh truyền nhiễm trong đó có cả bệnh AIDS (virus HIV). Nano bạc có khả năng vô hiệu hóa hầu như tất cả các enzyme cần thiết cho sự trao đổi oxygen của vi khuẩn, virút và nấm. Nano bạc có khả năng giết chết hơn 650 loại vi khuẩn khác nhau chỉ trong vòng một phút [31]. Tất cả các vi khuẩn không bị lờn với kháng sinh bạc và vì thế, các hạt nano bạc không bị mất tác dụng. Ngoài ra, các hạt nano bạc cũng sẽ giúp tạo ra các oxygen hoạt tính từ trong không khí hoặc từ trong nước và từ đó phá hủy các màng tế bào của vi khuẩn.

Hiện nay, các ứng dụng của bạc nano đang phát triển không ngừng đặc biệt là trong lĩnh vực y sinh, do đó nhu cầu về bạc nano trên thị trường sẽ không ngừng tăng lên. Trong khi đó, tổng hợp bạc nano theo các phương pháp cổ điển (hóa học, vật lý, hóa lý kết hợp) thường gây nhiều tác động xấu đến môi trường, chi phí đầu tư rất tốn kém, giá thành cao lại khó sản xuất rộng rãi, nên có thể nói phương pháp sinh tổng hợp là một xu hướng mang tính tất yếu. Phương pháp tổng hợp theo hướng này tạo ra các hạt nano bạc đạt tiêu chuẩn về kích thước và phân bố tốt hơn so với các phương pháp khác đồng thời mở ra triển vọng sản xuất với qui mô lớn. Các hạt nano cũng có thể được ổn định ngay trong quy trình sản xuất bởi các polymer sinh học. Nhằm tiếp cận với phương pháp mới này, tôi đã chọn đề tài “Nghiên cứu sinh tổng hợp nano bạc bằng vi khuẩn B.subtilis và B.licheniformis ” làm luận văn tốt nghiệp.
Đề tài hướng đến các mục tiêu sau:

ã Thu được vật liệu nano bạc có kích thước nhỏ, độ bền cao (trên 3 tháng) và hiệu suất kháng khuẩn cao (trên 90%) bởi vi khuẩn B.subtilis và B.licheniformis.
ã Xác định các điều kiện (lượng sinh khối, nồng độ AgNO3, thời gian phản ứng) thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp nano bạc ngoại bào (B.subtilis) và nội bào (B.licheniformis).
ã Dùng dung dịch nano bạc thu được để chế tạo vải kháng khuẩn
Những mục tiêu nêu trên được cụ thể hóa qua nội dung thực hiện sau đây:
ã Khảo sát thời gian tăng trưởng tối ưu của B.subtilis và B.licheniformis
ã Khảo sát ảnh hưởng của một số điều kiện (lượng sinh khối vi khuẩn, thời gian phản ứng, nồng độ AgNO3) đến quá trình sinh tổng hợp bạc nano.
ã Phân tích đặc điểm hóa lý của các dung dịch nano bạc thu được (khảo sát hình dạng, sự phân bố kích thước hạt -TEM, giản đồ nhiễu xạ tia X-XRD)
ã Kiểm tra khả năng ổn định, hoạt tính kháng khuẩn của dung dịch bạc nano được sinh tổng hợp từ chủng B.subtilis và B.licheniformis
ã Thử nghiệm ngâm tẩm vải non-woven với dung dịch nano bạc tổng hợp được và kiểm tra hiệu quả kháng khuẩn của mẫu vải sau khi ngâm.