Thạc Sĩ Nghiên cứu sản xuất protein FGF-2 tái tổ hợp trong vi khuẩn Escherichia coli

LỜI MỞ ĐẦU

Nhân tố tăng trưởng nguyên bào sợi FGF-2 (Fibroblast Growth Factor-2) là một protein đa chức năng, tham gia điều hòa hoạt động của nhiều quá trình trong cơ thể như cân bằng nội mô, ngăn chặn quá trình xơ hóa ở phổi, duy trì và tăng sinh tế bào thần kinh, chữa lành xương bị tổn thương, kích thích hình thành tế bào bạch cầu, kích thích sự hình thành mạch máu mới từ mạch máu sẵn có, kích thích sự tăng trưởng của tế bào cơ mềm, chữa lành vết thương và sửa chữa mô
Do sự đa dạng về chức năng, FGF-2 đang được quan tâm nghiên cứu để ứng dụng trong nhiều lĩnh vực. Nhờ khả năng kích thích tăng sinh, ức chế biệt hóa, FGF-2 đang được sử dụng như là thành phần không thể thiếu trong nuôi cấy tế bào gốc phôi người. Trong công nghệ mỹ phẩm, một số nghiên cứu cho thấy FGF-2 có khả năng làm đen tóc, ngăn ngừa sự lão hóa da nên ngày càng được các hãng mỹ phẩm tin tưởng và bổ sung vào các bộ sản phẩm chăm sóc da, tóc. Bên cạnh đó, trong lĩnh vực y học, việc sử dụng FGF-2 đã đem lại nhiều kết quả khả quan trong việc điều trị nhiều căn bệnh như bệnh thiếu máu tim cục bộ, điều trị bỏng, ngăn ngừa sẹo do phẫu thuật, chữa bệnh viêm nha chu
Trước đây, sản phẩm FGF-2 thường được thu nhận bằng cách tách chiết từ các dòng tế bào động vật. Việc sản xuất FGF-2 bằng phương pháp này đảm bảo về hoạt tính của sản phẩm nhưng sản lượng thấp và giá thành cao. Nhằm khắc phục những nhược điểm trên, người ta đã tiến đến việc ứng dụng công nghệ DNA tái tổ để sản xuất nhân tố FGF-2. Do đặc điểm của FGF-2 là không có cấu nối disulfide nội phân tử và không cần sự biến đổi sau dịch mã cho hoạt tính sinh học nên hệ thống chủng chủ E.coli có thể đảm nhiệm việc sản xuất FGF-2 có hoạt tính thay cho các dòng tế bào động vật.
Ở Việt Nam, FGF-2 chủ yếu được nhập từ các công ty nước ngoài nên giá thành rất cao (1mg protein FGF-2 người được sản xuất nhờ kĩ thuật gen có giá khoảng 1260 USD, ProSpec) gây khó khăn trong việc ứng dụng. Do đó, việc sản xuất FGF-2 trong nước nhằm đáp ứng nhu cầu sử dụng trên diện rộng với giá thành thấp cần được quan tâm đầu tư.
Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn đó, chúng tôi tiến hành đề tài “ Nghiên cứu sản xuất protein FGF-2 tái tổ hợp trong vi khuẩn Escherichia coli” nhằm tìm ra phương án sản xuất FGF-2 hiệu quả, kinh tế cho những ứng dụng trong nước. Tuy nhiên, một trong những hạn chế của việc sử dụng E. coli làm tế bào chủ là protein thường được tạo ra dưới dạng thể vùi không có hoạt tính, cần phải trải qua quá trình gấp cuộn phức tạp, tốn kém. Do vậy, luận văn này được thực hiện với mục đích xây dựng quy trình sản xuất FGF-2 trong đó sử dụng chủng chủ E. coli để cảm ứng biểu hiện protein dạng tan trong tế bào chất. Đây là hướng chiến lược hiệu quả và triển vọng cho phép sản xuất FGF-2 có hoạt tính một cách đơn giản với hiệu suất cao, giúp hạ giá thành sản phẩm.
Với mục tiêu trên, chúng tôi thực hiện luận văn với những nội dung sau:
- Tạo dòng E. coli BL21(DE3)/pET-FGF có khả năng biểu hiện vượt mức protein FGF-2 tái tổ hợp.
- Biểu hiện protein FGF-2 tái tổ hợp dạng tan trong tế bào chất E. coli BL21(DE3)/pET-FGF.
- Bước đầu lên men bằng hệ thống lên men ở quy mô 1 lít nhằm thu nhận FGF-2 tái tổ hợp dạng tan trong tế bào chất E. coli.
- Chứng minh hoạt tính kích thích tăng sinh dòng tế bào 3T3 của FGF-2 tái tổ hợp.

MỤC LỤC

MỤC LỤC i
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT . iii
DANH MỤC HÌNH v
DANH MỤC BẢNG vii
LỜI MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3
1.1. NHÂN TỐ TĂNG TRƯỞNG NGUYÊN BÀO SỢI FGF-2 4
1.1.1. Họ nhân tố tăng trưởng nguyên bào sợi FGF 4
1.1.2. Cấu trúc của FGF-2 .4
1.1.3. Chức năng của FGF-2 7
1.1.4. Ứng dụng của FGF-2 .8
1.2. BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP Ở Escherichia coli . 13
1.2.1. Giới thiệu chung 13
1.2.2. Một số hệ thống biểu hiện ở E. coli 16
1.2.3. Biểu hiện protein tái tổ hợp dạng tan trong tế bào chất E. coli 18
CHƯƠNG II. VẬT LIỆU-PHƯƠNG PHÁP . 21
2.1. VẬT LIỆU . 22
2.1.1. Dụng cụ và thiết bị . 22
2.1.2. Hóa chất 22
2.1.3. Môi trường 25
2.1.4. Vật liệu sinh học 26
2.2. PHƯƠNG PHÁP 28
2.2.1 Cấu trúc vector tái tổ hợp pET-FGF mang gen mã hóa protein FGF-2 28
2.2.2. Cấu trúc chủng biểu hiện E. coli BL21(DE3) mang vector tái tổ hợp pET-FGF (E. coli BL21(DE3)/pET-FGF) 36
2.2.3. Xác nhận sự biểu hiện FGF-2 dạng tan trong tế bào chất E. coli BL21(DE3) 36
2.2.4. Bước đầu lên men bằng hệ thống lên men ở quy mô 1 lít để thu nhận protein FGF-2 tái tổ hợp ở dạng tan . 37
2.2.5. Kiểm tra hoạt tính kích thích tăng sinh dòng tế bào 3T3 của FGF-2 tái tổ hợp [23] . 40
2.2.6. Các phương pháp phân tích protein 41
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ-BIỆN LUẬN . 46
3.1. CẤU TRÚC VECTOR TÁI TỔ HỢP pET-FGF MANG GEN MÃ HÓA PROTEIN FGF-2 47
3.1.1. Thu nhận gen fgf 47
3.1.2. Thu nhận vector pET-19b 48
3.1.3. Tạo dòng tế bào E. coli DH5α chứa vector tái tổ hợp pET-FGF . 49
3.1.4. Chọn lọc dòng tế bào E. coli mang vector tái tổ hợp pET-FGF . 50
3.2. CẤU TRÚC CHỦNG BIỂU HIỆN E. coli BL21(DE3) MANG VECTOR TÁI
TỔ HỢP pET-FGF (E. coli BL21(DE3)/pET-FGF) . 54
3.2.1. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E. coli BL21(DE3) bằng phương
pháp hóa biến nạp 54
3.2.2. Sàng lọc dòng tế bào E. coli BL21(DE3)/pET-FGF . 55
3.3. XÁC ĐỊNH SỰ BIỂU HIỆN FGF-2 DẠNG TAN TRONG TẾ BÀO CHẤT E. coli 55
3.4. BƯỚC ĐẦU LÊN MEN BẰNG HỆ THỐNG LÊN MEN Ở QUY MÔ 1 LÍT ĐỂ THU NHẬN PROTEIN FGF-2 TÁI TỔ HỢP DẠNG TAN 57
3.5. KIỂM TRA HOẠT TÍNH KÍCH THÍCH SỰ TĂNG SINH DÒNG TẾ BÀO 3T3 CỦA FGF-2 TÁI TỔ HỢP . 60
CHƯƠNG IV. KẾT LUẬN-ĐỀ NGHỊ 63
4.1. KẾT LUẬN 64
4.2. ĐỀ NGHỊ . 64
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 65
TÀI LIỆU THAM KHẢO . 66
PHỤ LỤC . 69