Luận Văn Nghiên cứu sản xuất kháng thể thỏ kháng ovalbumin dùng phát hiện ovalbumin trong vacxin cúm a/h5n1

MỤC LỤC
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
LỜI NÓI ĐẦU 1
1.1. TÌNH HÌNH BỆNH CÚM A/H5N1 4
1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VACXIN CÚM A/H5N1 HIỆN NAY 5
1.3. GIỚI THIỆU VACXIN CÚM A/H5N1 SẢN XUẤT TRÊN TRỨNG GÀ CÓ PHÔI 6
1.3.1. Nguyên liệu sản xuất 6
1.3.2. Chủng sản xuất 6
1.3.3. Quy trình sản xuất và kiểm định vacxin cúm A/H5N1 trên trứng gà có phôi 7
1.3.4. Tiêu chuẩn chất lượng của vacxin cúm A/H5N1 7
1.4. OVALBUMIN 8
1.4.1. Đặc tính 8
1.4.2. Cấu tạo 9
1.4.3. Tính sinh miễn dịch 9
1.5. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN OVALBUMIN VÀ KHUYẾN CÁO VỀ CÁCH PHÁT TRIỂN VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP 10
1.5.1. Các phương pháp phát hiện ovalbumin 10
1.5.1.1. Phương pháp Ouchterlony (khuyếch tán miễn dịch kép) 11
1.5.1.2. Phương pháp điện di miễn dịch đối lưu 11
1.5.1.3. Phương pháp miễn dịch phóng xạ (Radioimmunoassay- RIA) 12
1.5.1.4. Phương pháp ELISA – Kỹ thuật chất hấp phụ miễn dịch gắn enzyme (Enzyme – Linked immunosorbent Assay). 12
1.5.2. Các khuyến cáo về cách phát triển và thẩm định phương pháp 14
1.6 SẢN XUẤT KHÁNG THỂ VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP TINH CHẾ 15
1.6.1. Tá chất 15
1.6.2. Quy trình gây miễn dịch cơ bản tạo kháng thể đa dòng 16
1.6.3. Tinh chế kháng thể IgG 17
1.6.3.1. Kết tủa IgG từ huyết thanh hoặc dịch sinh vật khác bằng (NH[SUB]4[/SUB])[SUB]2[/SUB]SO[SUB]4[/SUB]. 18
1.6.3.2. Tinh chế IgG nhờ sắc kí trao đổi ion. 18
1.6.3.3. Tinh chế IgG nhờ cột ái lực protein A- hoặc protein G-sepharose 4B 19
1.6.4. Kiểm tra nồng độ và độ sạch của huyết thanh sau tinh chế 20
2.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 22
2.2. VẬT LIỆU 22
2.2.1. Sinh phẩm 22
2.2.2. Súc vật thí nghiệm 22
2.2.3. Hoá chất và dung dịch chuẩn. 22
2.2.4. Thiết bị 23
2.2.5. Dụng cụ. 24
2.3. PHƯƠNG PHÁP. 24
2.3.1. Miễn dịch thỏ thu huyết thanh kháng ovalbumin. 24
2.3.2. Xác định hiệu giá kháng thể thỏ kháng ovalbumin bằng phương pháp khuyếch tán miễn dịch kép (Ouchterlony). 26
2.3.2.1. Nguyên tắc. 26
2.3.2.2. Tiến hành. 26
2.3.3. Tinh chế kháng thể kháng ovalbumin bằng cột HiTrap protein G HP. 27
2.3.3.1. Tinh chế 27
2.3.3.2. Phương pháp điện di SDS-PAGE kiểm tra độ sạch của huyết thanh sau tinh chế 28
2.3.4. Phương pháp điện di miễn dịch đối lưu. 30
2.3.5. Xây dựng phương pháp ELISA định lượng ovalbumin trong vacxin cúm A/H5N1. 31
2.3.5.1. Nguyên lý. 31
2.3.5.2. Các bước tiến hành. 31
2.3.6. Thẩm định phương pháp. 33
2.3.6.1. Xây dựng đường chuẩn và độ nhạy của phản ứng. 33
2.3.6.2. Xác định độ chính xác của phương pháp. 33
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 36
3.1. ĐÁNH GIÁ QUY TRÌNH MIỄN DỊCH VÀ SẢN XUẤT KHÁNG THỂ THỎ KHÁNG OVALBUMIN 37
3.2. TINH CHẾ KHÁNG THỂ THỎ (IgG) KHÁNG OVALBUMIN 40
3.3. XÂY DỰNG HỆ ELISA ĐỊNH LƯỢNG OVALBUMIN. 43
3.3.1. Chọn hệ đệm khóa phiến. 43
3.3.2. Xác định nồng độ kháng thể phù hợp cho phủ phiến. 44
3.4. THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP. 46
3.4.1. Xây dựng đường chuẩn. 46
3.4.2. Kết quả xác định độ nhạy của phản ứng. 47
3.4.3. Kết quả xác định độ chính xác và độ đúng của phương pháp 49
3.4.4. So sánh với phương pháp điện di miễn dịch đối lưu. 55
3.5. ỨNG DỤNG HỆ ELISA ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG OVALBUMIN TRONG TRONG VACXIN CÚM A/H5N1. 56
4.1. KẾT LUẬN 59
4.1.1. Sản xuất kháng thể thỏ kháng ovabumin. 59
4.1.2. Đã sử dụng cột HiTrap protein G HP tinh chế thành công kháng thể (IgG) kháng ovalbumin từ huyết thanh thỏ thô. 59
4.1.3. Xây dựng và thẩm định được hệ ELISA gián tiếp định lượng ovalbumin trong vacxin cúm A/H5N1. 59
4.2. KIẾN NGHỊ 60
TÀI LIỆU THAM KHẢO 1