Luận Văn Nghiên cứu sản xuất kháng nguyên polyhedrin và kháng thể kháng polyhedrin để tạo bộ sinh phẩm phát h

ĐẶT VẤN ĐỀ
Nuôi trồng thuỷ sản là một ngành kinh tế quan trọng, đóng góp một phần đáng kể về nhu cầu tiêu dùng và thị phần xuất khẩu của một số quốc gia trên thế giới, đặc biệt là các nước ở Châu Á. Trong đó nuôi tôm là một trong những ngành công nghiệp mũi nhọn mang lại danh thu nhiều tỷ dola mỗi năm. Đối với việc nuôi tôm trên thế giới, từ năm 1984 – 1995 sản lượng tăng hàng năm khoảng 16,8% (FAO 1997). Theo thông báo của hội nghị genome tôm sú họp tại Bangkok – Thái Lan (ngày23/10/2004) thu nhập do xuất khẩu tôm ở các nước Châu Á đã vượt quá 4 tỷ USD mỗi năm [08][17].
Ở Việt Nam hơn 10 năm trở lại đây ngành nuôi tôm cũng phát triển mạnh. Năm 2001 diện tích nuôi tôm thương phẩm đạt 230.000 ha [5][8]. Đặc biệt là vùng đồng bằng sông cửu long sản lượng tôm chiếm trên 50% của cả nước. Sự gia tăng về sản lượng tôm nuôi trong những năm gần đây đó là nhờ phương pháp nuôi tôm tốt và chủ yếu là dựa vào sự phát triển của nghề nuôi tôm sú (1995 sản lượng tôm sú chiếm trên 90% tổng sản lượng tôm nuôi). Tuy nhiên song song với việc tăng sản lượng tôm nuôi thì hiện nay ngành công nghiệp này đang bị tổn thất nghiêm trọng bởi dịch bệnh bùng phát và xuất hiện nhiều bệnh lạ chưa có biện pháp để chuẩn đoán và điều trị. Bệnh do vi khuẩn, virus, nấm và các nguyên sinh động vật gây ra. Hiện nay một số bệnh thường xuất hiện trên tôm như: Bệnh virus đốm trắng WSSV (White Spost Synodrom Virus), bệnh do vi khuẩn Vibrio, bệnh còi (Monodon Baculovirus MBV), bệnh do dinh dưỡng, bệnh do kí sinh trùng
Việc gia tăng hoạt động nuôi trồng thuỷ sản đã đi kèm với tốc độ bùng nổ dịch bệnh, gây tổn thất lớn về kinh tế trong ngành thuỷ sản. Bệnh trên tôm nhất là bệnh do virus, luôn là nỗi ám ảnh của người nuôi trồng và là nỗi quan tâm hàng đầu của các nhà khoa học. Trong lĩnh vưc nghiên cứu về bệnh thuỷ sản trên thế giới nói chung và ở Việt Nam nói riêng, sự hiểu biết về tác nhân gây bệnh, tính chất lan truyền còn ít ỏi. Đặc biệt là việc chuẩn đoán bệnh do virus rất phức tạp, đòi hỏi nức độ kỹ thuật cao, trang thiết bị chuyên dụng và đắt tiền mà tại điểm sản xuất không có khả năng thực hiện được do đó ngành nuôi tôm hiện nay đang phải gánh chịu hậu quả do dịch bệnh gây ra.
Để có thể sản xuất được bộ sinh phẩm chuẩn đoán bệnh còi do virus MBV ở tôm trước hết phải có kháng nguyên tinh chế và kháng thể chuẩn. Với lý do nêu trên chúng tôi tiến hành đề tài “ Nghiên cứu sản xuất kháng nguyên polyhedrin và kháng thể kháng polyhedrin để tạo bộ sinh phẩm phát hiện monodon baculovirus (MBV)”.
Mục lục
ĐẶT VẤN ĐỀ . 1
PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Giới thiệu chung về bệnh MBV (Monodon baculovirus) 3
1.1.1. Bệnh MBV 3
1.1.2. Tình hình nghiên cứu bệnh MBV 4
1.1.2.1. Trên thế giới . 4
1.1.2.2. Ở Việt Nam 6
1.1.3. Đặc điểm tôm nhiễm bệnh MBV . 7
1.1.4. Phương pháp chuẩn đoán và phòng bệnh MBV 8
1.1.4.1. Phương pháp chuẩn đoán . 8
1.1.4.2. Phương pháp phòng bệnh 8
1.1.5. Đặc điểm virus học 9
1.1.5.1. Đặc điểm sinh học[21][32] 9
1.1.5.2. Khả năng gây bệnh của virus MBV . 9
1.1.5.3. Đặc điểm hình thái và cấu trúc . 9
1.2. Kháng nguyên [34] . 10
1.2.1. Các đặc điểm để xác định kháng nguyên 10
1.2.1.1. Kích cỡ kháng nguyên [43][45][33] 10
1.2.1.2. Tính khác lạ của kháng nguyên 11
1.2.1.3. Tính độc của kháng nguyên 11
1.2.2 Kháng nguyên Polyhedrin 11
1.3. Kháng thể . 11
1.3.1. Cấu trúc kháng thể . 11
1.3.2 Tính đặc hiệu của kháng nguyên – kháng thể . 13
1.3.3 Ảnh hưởng của kháng nguyên đến sự hình thành của kháng thể 13
PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 15
2.1. Vật liệu . 15
2.1.1 Động vật thí nghiệm . 15
2.1.2. Các thiết bị thí nghiệm . 15
2.1.3. Hóa chất cần thiết 15
2.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu 15
2.2.1. Nội dung nghiên cứu 15
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu . 16
2.2.2.2 Xác định rõ sự nhiễm MBV bằng kỹ thuật nhuộm mẫu tươi 16
2.2.2.3. Xác định mức độ nhiễm MBV ở tôm và quan sát thể ẩn trong gan tụy tôm bằng kỹ thuật nhuộm mẫu cắt mô tế bào 16
2.2.2.4. Khẳng định tôm nhiễm MBV bằng PCR 17
2.2.2.5. Phương pháp tinh chế polyhedrin 17
2.2.2.6. Phương pháp Bradford (BioRad protein assay kit, Bio Rad Corp., Hercules, CA, USA) 18
2.2.2.7. Phương pháp điện di protein trên gel polyacrylamid . 19
2.2.2.9. Phương pháp gây miễn dịch chuột . 21
2.2.2.10. Phương pháp lấy tế bào nuôi (Feeder cell) 21
2.2.2.11. Phương pháp nuôi cấy tế bào Myeloma . 22
2.2.12. Dung hợp tạo tế bào lai (Hybridoma) sinh kháng thể 23
2.2.2.13. Tạo dòng tế bào lai (hybridoma) sinh kháng thể đơn dòng [30]. 24
2.2.2.14. Sản xuất dịch báng chuột chứa kháng thể đơn dòng . 25
2.2.2.15. Phương pháp tinh sạch kháng thể 25
2.2.2.16. Phương pháp ELISA 26
2.2.2.17. Phương pháp Western Blot 27
2.2.2.18. Tinh chế kháng thể đơn dòng từ dịch báng chuột . 27
PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29
3.1. Kết quả Gây nhiễm MBV cho tôm post larvae (PL 10- 15) . 29
3.2. Kết quả tinh chế protein polyhedrin và virion của MBV . 31
3.3. Kết quả Gây miễn dịch cho chuột bằng protein polihedrin tự nhiên tinh sạch từ tôm bệnh . 33

3.4. Kết quả dung hợp tế bào lympho B mẫn cảm kháng nguyên polihedrin với tế bào myeloma để tạo tế bào lai hybridoma sinh kháng thể đơn dòng 35
3.5. Tách dòng bằng phươnh pháp pha loãng tới hạn . 38
3.6. Kết quả kiểm tra tính đặc hiệu của kháng thể đơn dòng với kháng nguyên polyhedrin tự nhiên ở tôm mắc bệnh MBV 40
KẾT LUẬN . 42
KIẾN NGHỊ 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO 43