Tiến Sĩ Nghiên cứu sản xuất HTKN-RCN đa giá từ huyết tương ngựa; đánh giá chất lượng chế phẩm trong phòng th

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC
NĂM 2013

Mục lục
Bảng chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các đồ thị, sơ đồ
Danh mục các ảnh
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .

1.1. MÁU VÀ HUYẾT TƯƠNG .
1.1.1. Máu
1.1.2. Huyết tương
1.2. CÁC LOẠI CHẾ PHẨM MÁU VÀ CHẾ PHẨM HUYẾT TƯƠNG
1.2.1. Máu toàn phần
1.2.2. Khối hồng cầu .
1.2.3. Khối tiểu cầu .
1.2.4. Huyết tương tươi đông lạnh
1.2.5. Tủa VIII (Cryo) .
1.2.6. Huyết tương tươi đã tách tủa
1.2.7. Huyết tương đông lạnh .
1.2.8. Khối bạch cầu hạt
1.2.9. Albumin .
1.2.10. Gamma globin
1.2.11. Kháng huyết thanh
1.3. PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT CÁC THÀNH PHẦN HUYẾT
TƯƠNG .
1.3.1. Phương pháp tủa bằng Ethanol .
1.3.2. Phương pháp tủa bằng muối .
1.3.3. Phương pháp sắc ký
1.3.4. Phương pháp miễn dịch hấp phụ .
1.3.5. Phương pháp lọc qua màng ma trận với các vật rắn
1.4. HUYẾT THANH KHÁNG NỌC RẮN .
1.4.1. Khái niệm .
1.4.2. Lịch sử phát minh
1.4.3. Cơ sở Miễn dịch học .
1.4.3.1. Kháng nguyên nọc rắn .
1.4.3.2. Kháng thể chống nọc rắn .
1.4.4. Các giai đoạn của quy trình sản xuất HTKNR
1.4.4.1. Chế tạo kháng nguyên nọc rắn
1.4.4.2. Gây mẫn cảm tạo nguồn huyết tương giàu kháng thể .
1.4.4.3. Thu hoạch huyết tương giàu kháng thể
1.4.4.4. Tinh chế HTKNR .
1.4.4.5. Đánh giá chất lượng sản phẩm
1.5. TAI NẠN DO RẮN CẠP NIA VÀ TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT HTKN-RCN TẠI VIỆT NAM
1.5.1. Tình hình tai nạn do rắn cạp nia tại Việt Nam
1.5.2. Chi rắn cạp nia Việt Nam
1.5.3. Đặc điểm nọc rắn cạp nia và cơ chế bệnh sinh
1.5.4. Tình hình nghiên cứu sản xuất HTKN-RCN .
1.5.4.1. Trên thế giới .
1.5.4.2. Tại Việt Nam

Chương 2. ÐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU .
2.1.1. Động vật thí nghiệm .
2.1.2. Vật liệu nghiên cứu
2.1.3. Hóa chất, sinh phẩm .
2.1.4. Dụng cụ, phương tiện, trang bị .
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .
2.2.1. Thiết kế nghiên cứu
2.2.2. Tiêu chuẩn chất lượng sản phẩm cần đạt .
2.2.2.1. Tiêu chuẩn Quốc gia .
2.2.2.2. Tiêu chuẩn của WHO .
2.2.3. Nội dung nghiên cứu .
2.2.3.1. Nghiên cứu sản xuất HTKN-RCN đa giá F(ab’)2
2.2.3.2. Đánh giá chất lượng chế phẩm trong phòng thí nghiệm
2.2.4. Các phương pháp, kỹ thuật nghiên cứu
2.2.4.1. Chọn rắn cạp nia, lấy nọc, bảo quản nọc
2.3.4.2. Chế tạo kháng nguyên nọc đa giá giảm độc lực .
2.2.4.3. Gây mẫn cảm ngựa, theo dõi hình thành KT đặc hiệu 2.2.4.4. Thu hoạch huyết tương giàu kháng thể .
2.3.4.5. Kỹ thuật tinh chế HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 .
2.2.4.6. Phương pháp đánh giá chất lượng HTKNR .
2.2.5. Thời gian và địa điểm nghiên cứu .
2.2.6. Xử lý số liệu .
2.2.7. Sơ đồ nghiên cứu
3.1. NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT HUYẾT THANH KHÁNG NỌC RCN ĐA GIÁ F(ab’)2 ĐÁP ỨNG TIÊU CHUẨN VIỆT NAM
3.1.1. Kết quả chế tạo KN, đánh giá chất lượng KN
3.1.1.1. Tuyển chọn và lấy nọc rắn rắn cạp nia .
3.1.1.2. Kết quả sơ bộ về phân bố của chi RCN ở Việt Nam .
3.1.1.3. Kết quả chế tạo KN nọc RCN đa giá, giảm độc lực
3.1.1.4. Kết quả kiểm tra chất lượng kháng nguyên .
3.1.2. Kết quả gây mẫn cảm ngựa và theo dõi đáp ứng miễn dịch .
3.1.2.1. Liều lượng kháng nguyên và tá dược gây mẫn cảm .
3.1.2.2. Kết quả theo dõi sức khỏe ngựa sau gây mẫn cảm .
3.1.2.3. Hiệu giá kháng thể sau mỗi lần gây mẫn cảm .
3.1.2.4. Xác định KT đặc hiệu với KN nọc rắn cạp nia đa giá
3.1.3. Kết quả lấy máu, tách huyết tương, truyền trả khối HC .
3.1.4. Kết quả tinh chế HTKN-RCN đa giá F(ab’)2
3.1.4.1. Cắt Fc bằng pepsin, lọc bỏ tủa
3.1.4.2. Tủa F(ab’)2, lọc thu tủa, thẩm tích và lọc vô trùng
3.1.4.3. Xác định độ tinh sạch của sản phẩm .
3.2. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG CHẾ PHẨM NGHIÊN CỨU
3.2.1. Kết quả kiểm định chất lượng tại cơ sở .
3.2.1.1. Thử nghiệm an toàn (Safety test) .
3.2.1.2. Thử nghiệm chí nhiệt tố (Pyrogen test) .
3.2.1.3. Thử nghiệm vô khuẩn (Sterility test) .
3.2.1.4. Thử nghiệm công hiệu (Potency test)
3.2.1.4.a. Xác định LD50 của nọc RCN
3.2.1.4.b. Xác định Hiệu lực (ED50) .
3.2.2. Kết quả kiểm định chất lượng cấp Quốc gia .
3.2.3. Tính khái quát giá thành sản xuất

Chương 4. BÀN LUẬN
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .
4.1. SẢN XUẤT HTKN-RCN ĐA GIÁ F(ab)2 ĐÁP ỨNG TIÊU CHUẨN VIỆT NAM
4.1.1. Chế tạo kháng nguyên
4.1.2. Qui trình gây mẫn cảm, theo dõi đáp ứng miễn dịch .
4.1.3. Những lưu ý khi lấy máu, tách huyết tương, truyền trả khối HC.
4.1.4. Kỹ thuật tinh chế HTKN-RCN đạt chất lượng cao .
4.2. ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG CHẾ PHẨM HTKN-RCN ĐA GIÁ F(ab’)2 TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM
4.2.1. Kiểm định cơ sở và vấn đề kiểm soát chất lượng
4.2.1.1. Tính “An toàn” của chế phẩm
4.2.1.2. Hiệu lực của chế phẩm nghiên cứu
4.2.2. Khẳng định chất lượng của kiểm định Quốc gia .
4.2.3. Về giá thành, hiệu quả kinh tế-xã hội, qui mô sản xuất .


KẾT LUẬN .
KIẾN NGHỊ .
DANH MỤC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN


ĐẶT VẤN ĐỀ
Theo WHO ước tính, mỗi năm Việt Nam cần khoảng 1,7 triệu đơn vị máu phục vụ cấp cứu điều trị (2% dân số) [40], ngoài máu toàn phần và các chế phẩm máu, chế phẩm huyết tương, còn phải kể đến các chế phẩm huyết thanh như: gamma globulin, anti-HBs globulin, anti-T lymphocyte globulin, anti-D globulin, antivenom [141],[147],[152] .trong đó, huyết thanh kháng nọc rắn (antivenom) là một loại chế phẩm rất quan trọng, đặc biệt trong điều trị rối loạn đông cầm máu do nhiễm độc nọc rắn họ Vipridae.
Là nước nhiệt đới, với ¾ diện tích rừng núi và đất nông nghiệp, bờ biển dài hơn 3000 km, Việt Nam có môi trường rất thuận lợi cho rắn độc phát triển. Mặt khác, phần lớn cư dân sinh sống, làm việc trong môi trường nông nghiệp, rừng núi, hải đảo .nguy cơ bị rắn độc cắn rất cao (> 30.000 người /năm [21]); ngoài tổn thất nhân mạng, chi phí điều trị rất tốn kém: nhiều nạn nhân phải thở máy hàng tháng hoặc phải truyền hàng chục lít máu và huyết tương để cứu tính mạng; kỷ lục, đầu tháng 6/2013, bệnh viện Bạch Mai đã phải truyền ≈ 46 lít máu và chế phẩm để cứu một người bệnh [174].
Nhằm giảm thiểu tỷ lệ tử vong, giảm số lượng máu và huyết tương phải sử dụng trong điều trị rắn độc cắn, Bộ y tế đã quan tâm chỉ đạo việc nghiên cứu, ứng dụng sản xuất huyết thanh kháng nọc rắn (HTKNR) [6],[8]. Đến nay, đã có một số nghiên cứu rất thành công, góp phần cứu sống hàng ngàn bệnh nhân, giảm mạnh lượng máu và chế phẩm phải sử dụng [6],[21],[23] .
Tuy vậy, sau nhiều năm nỗ lực, đến nay chúng ta vẫn đang thiếu trầm trọng nhiều loại HTKNR; hầu như chỉ có duy nhất hai loại HTKNR cho rắn hổ đất và rắn lục tre [8],[165],[166],[171]. Do tính đặc hiệu kháng nguyên nọc rắn theo vùng địa lý, mỗi quốc gia phải tự chế tạo HTKNR cho chính quốc gia mình (khuyến cáo của WHO) [141],[20],[6]. Để đáp ứng nhu cầu cấp cứu, điều trị rắn độc cắn, chúng ta rất cần đẩy mạnh nghiên cứu, sản xuất HTKNR; đặc biệt là các HTKNR cho các loài rắn độc nguy hiểm, thường gặp; trong các loài đó, hàng đầu phải kể đến rắn cạp nia, chiếm 35,8% các loài rắn độc họ rắn hổ (Elapidae) tại Việt Nam, là loài rắn độc có độc tính cực mạnh, gây tử vong rất cao (> 80% nếu không được cấp cứu điều trị kịp thời) [14].
Thực tế điều trị rắn cạp nia cắn ở Việt Nam từ trước đến nay cho thấy: nước ta có hai loài rắn cạp nia thường gặp chủ yếu là rắn cạp nia nam (Bungrarus candidus) và rắn cạp nia bắc (Bungarus multicinctus). Đây là hai loài rắn có hình dạng “khúc đen, khúc trắng” rất giống nhau, thoáng nhìn rất khó phân biệt. Hai loài rắn này khác nhau cả về độc tính nọc và biểu hiện lâm sàng, chẩn đoán rất dễ nhầm lẫn, HTKNR đơn đặc hiệu không có tác dụng chéo và cũng chưa có VDK để chẩn đoán xác định [15].
Nghiên cứu sản xuất HTKNR đa giá cho cả hai loài rắn độc nguy hiểm nói trên là giải pháp đem lại thuận lợi cho cấp cứu điều trị bệnh nhân rắn cạp nia cắn trong cả nước. Để tăng tính an toàn của chế phẩm, dạng F(ab’)2 là tối ưu, đồng thời phải áp dụng các giải pháp kỹ thuật và kiểm soát chất lượng toàn diện để chế phẩm có thể đạt Tiêu chuẩn Quốc gia về HTKNR dùng cho người, theo Dược điển Việt Nam [9].
Với các lý do trên, đề tài “Nghiên cứu sản xuất HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 từ huyết tương ngựa; đánh giá chất lượng chế phẩm trong phòng thí nghiệm” được thực hiện, nhằm các mục tiêu sau:
1. Nghiên cứu sản xuất HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 từ huyết tương ngựa, đạt Tiêu chuẩn Quốc gia.
2. Đánh giá chất lượng chế phẩm trong phòng thí nghiệm.