Thạc Sĩ Nghiên cứu sản xuất các gam chuẩn cho RT-PCR, ứng dụng trong chẩn đoán cúm và kiểm định công hiệu vắ

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cho đến năm 2013-2014, sởi vẫn còn là “kẻ giết hại trẻ em”, đặc biệt ở những nước đang phát triển, trong đó có Việt Nam. Vắc xin góp phần quyết định khống chế và thanh toán sởi toàn cầu. Kiểm định công hiệu vắc xin bằng các phương pháp thông thường tốn thời gian, công sức, và kết quả đôi khi phụ thuộc chủ quan người đọc trong khi real-time có thể khắc phục được những điểm này.
Lịch sử đã ghi nhận 5 đại dịch cúm với hơn 20 triệu người trên thế giới tử vong năm 1918. Việt Nam là một điểm nóng của lưu hành cúm, bao gồm cả A/H1N1pdm09.
Có thể chẩn đoán sởi và cúm cũng như xác định phân típ cúm A bằng RT-PCR. Để có thể kiểm soát chất lượng và định lượng ARN thì cần gam chuẩn ngoài (chứng dương đã biết nồng độ). Phiên mã in vitro cho ARN đồng nhất, tinh khiết, định lượng được, an toàn, và có sản lượng cao. Đề tài “Nghiên cứu sản xuất các gam chuẩn cho RT-PCR, ứng dụng trong chẩn đoán cúm và kiểm định công hiệu vắc xin sởi” có mục tiêu:
1. Sản xuất được các gam chuẩn cho RT-PCR phát hiện đồng thời ARN virus cúm A, B (M); cúm A/H5N1 (M, H5 và N1); và sởi (N);
2. Xác định tỷ lệ nhiễm cúm mùa và phân típ cúm gia cầm A/H5N1 (nếu có) tại Hải Dương năm 2009 bằng RT-PCR;
3. Xác định công hiệu vắc xin sởi đơn sản xuất tại Việt Nam bằng real-time RT-PCR một bước.

NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
1. Nghiên cứu đã sản xuất hàng loạt chứng dương ARN với sản lượng cao (10[SUP]11[/SUP]-10[SUP]19[/SUP] bản sao/phản ứng 20µl) bằng cả hai kỹ thuật phiên mã cổ điển và trực tiếp;
2. Nghiên cứu đã đưa ra được tỷ lệ phát hiện cúm mùa và cúm A/H1N1pdm09 ở bệnh nhân viêm đường hô hấp cấp tính nặng, nhập viện tại Hải Dương 2009-2011;
3. Nghiên cứu đã xây dựng và tiền thẩm định phương pháp mới xác định nhanh công hiệu vắc xin sởi đơn, sống giảm độc lực bằng định lượng trực tiếp ARN bên trong tế bào gây nhiễm bằng real-time RT-PCR.

BỐ CỤC LUẬN ÁN
Luận án bao gồm 147 trang, Đặt vấn đề 2 trang, Kết luận 1 trang, Đề xuất 1 trang, Những đóng góp mới của luận án 1 trang. Luận án có 4 chương: Chương 1: Tổng quan 37 trang; Chương 2: Đối tượng, vật liệu và phương pháp nghiên cứu 25 trang; Chương 3: Kết quả nghiên cứu 33 trang; Chương 4: Bàn luận 44 trang. Luận án có 47 Hình, 22 Bảng và 182 tài liệu tham khảo, bao gồm 17 tài liệu tiếng Việt, 158 tài liệu tiếng Anh, 2 tài liệu tiếng Pháp và 5 trang thông tin.

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1.Tổng quan một số vấn đề về cúm
1.1.1. Phép gọi tên và hình thái và cấu trúc
Các virus cúm thuộc trên họ Mononegavirale, họ Orthomyxoviridae, được phân thành các chi A, B, và C. Virus cúm A gồm các phân típ, virus cúm B và cúm C chỉ có một phân típ.
Hạt virus cúm đa hình thái, dạng hình cầu có kích thước 80-120nm. Cấu trúc hạt virus gồm bộ máy di truyền (genome), capsid và vỏ ngoài (envelop). Genome là một sợi ARN phân cực âm, có 8 phân đoạn với cúm A và B, 7 phân đoạn với cúm C.
1.1.2. Kháng nguyên, tính đa dạng chủng virus cúm A và dịch tễ học
Chuyển đổi kháng nguyên đột ngột (shift) là thay đổi cấu trúc kháng nguyên bề mặt, thường gây hiện tượng thay thế một loại HA mới, nhìn chung không chịu tác dụng của miễn dịch tồn tại trước đó và đây là nguyên nhân của các vụ đại dịch cúm.
Biến đổi kháng nguyên từ từ (drift) là những thay đổi nhỏ và liên tục các acid amin tại các khu vực kháng nguyên protein vỏ HA và NA. Những chủng này vẫn chịu một phần miễn dịch tồn tại trước đó.
Virus cúm truyền bệnh qua đường không khí. Cúm xảy ra quanh năm và trên toàn thế giới. Cúm A và B có thể đồng thời lưu hành trong cùng một năm nhưng thường mỗi mùa chỉ có một phân típ cúm A nổi lên.
1.1.3. Sự nhân lên của virus cúm
Virus hấp phụ trên bề mặt tế bào vật chủ qua thụ thể acid sialic và xâm nhập vào tế bào qua con đường endocytosis. Nhờ pH thấp của khoang nội bào mà HA tạo hiện tượng tiền thay đổi phù hợp để màng virus hòa với màng khoang nội bào. Tại nhân, ARN virus đóng vai trò làm khuôn mẫu tổng hợp ARN bổ trợ chuỗi dương, sau đó đến lượt ARN chuỗi dương này làm khuôn mẫu để tổng hợp ARN chuỗi âm và ARN thông tin. Hạt virus được giải phóng theo cơ chế nảy chồi.
1.1.4. Chẩn đoán phòng thí nghiệm
Vai trò phòng thí nghiệm là chẩn đoán kịp thời cho lâm sàng và báo cáo thông tin về sự xuất hiện và lưu hành các chủng virus cúm trong cộng đồng. Phương pháp chẩn đoán phòng thí nghiệm cúm gồm i/. chẩn đoán trực tiếp phát hiện hình thể virus (phân lập virus cúm), phát hiện kháng nguyên virus (miễn dịch huỳnh quang) xác định cúm A, cúm B hay phân típ cúm A hoặc ELISA xác định cúm A, cúm B, cúm C), phát hiện vật liệu di truyền của virus (RT-PCR xác định cúm A, cúm B, cúm C hay phân típ cúm A) cho phép chẩn đoán nhanh, đặc hiệu, và có tính sàng lọc cả cúm A và phân típ cúm A ii/. chẩn đoán gián tiếp phát hiện kháng thể bằng các phương pháp huyết thanh học.
Chẩn đoán cúm bằng RT-PCR có thể áp dụng kỹ thuật khuếch đại cổ điển hoặc định lượng trực tiếp, có thể sử dụng phản ứng đơn mồi hoặc đa mồi phát hiện đồng thời hơn 1 phân típ hay chi (A/H3N2, A/H1N1, A/H1N1pdm09, cúm B), và xác định chính xác phân típ (HA và NA), phát hiện đồng thời virus cúm mùa A (A/H3N2 và A/H1N1), virus cúm B cùng các virus khác như virus hợp bào hô hấp ở người (human respiratory syncytial virus - hRSV) hoặc virus gây viêm phổi ở người (human metapneumovirus - hMPV) .
1.1.5. Tình hình nghiên cứu về cúm
Các nghiên cứu về cúm được tiến hành ở mọi khía cạnh và loại hình nghiên cứu. Nghiên cứu về cúm của Việt Nam có thể bao gồm chẩn đoán và nghiên cứu huyết thanh học, sinh học phân tử, miễn dịch học, mô hình toán học, sản xuất vắc xin, tính nhạy cảm với oseltamivir, giám sát trọng điểm hội chứng cúm (Influenza-Like Illness - ILI), viêm phổi nặng do virus (Severe Viral Pneumonia - SVP), thử nghiệm lâm sàng .
Sau 2 tháng xuất hiện, 11/06/2009, WHO đã công bố đại dịch cúm A/H1N1pdm09. Sau một năm, hầu như tất cả các nước đều công bố có cúm A/H1N1pdm09. Hiện tại chủng cúm này đã được coi là một chủng cúm mùa. Tại Việt Nam, tính đến 19/03/2010, trên cả nước có 11.214 trường hợp được chẩn đoán xác định phòng thí nghiệm và 58 ca tử vong.
Tại Trung quốc, cúm lưu hành quanh năm nhưng chủ yếu từ tháng 1-8. Tỷ lệ nhiễm cúm giai đoạn 2009-2012 dao động từ 10-26% các trường hợp ILI (bao gồm cả cúm A/H1N1pdm09). Tại Camphuchia, cúm thường lưu hành vào tháng 8-11, tỷ lệ dương tính với cúm A từ năm 2006-2010 tương ứng là 5,8%; 7,7%; 15,3%; 15,2%; và 1,4%. Cúm B lưu hành quanh năm. Tại Lào, cúm lưu hành chủ yếu vào mùa đông-xuân, tỷ lệ dương tính cúm A trung bình là 9,0%. Tại Hoa Kỳ, tỷ lệ nhiễm cúm từ 5-20%. Tại Pháp, cúm cũng thường lưu hành vào mùa đông-xuân với tỷ lệ trung bình 5-15%.
Tại Việt Nam, theo Nguyễn Thu Yến và cộng sự, tỷ lệ dương tính với cúm ở những người ILI bằng RT-PCR là 22% và luôn chỉ có một chủng cúm A nổi trội (A/H1N1 hoặc A/H3N2). Tỷ lệ dương tính khá tương đồng giữa các loại cơ sở y tế (20-23%) và các vùng miền (21-23%). Cúm B lưu hành ở tất cả các năm, quanh năm và không liên quan đến phân típ cúm A. Năm 2009, tỷ lệ dương tính cúm A/H1N1pdm09 là 9,4%, năm 2010 là 2,1%. Đỉnh nhiễm cúm thường từ tháng 5-10. Ở các trường hợp viêm phổi nặng (SVP), cúm A/H1N1pdm09 chiếm 6,1%, cúm mùa A/H1N1 và A/H3N2 là 2,8%, cúm B là 2,2%, cúm A/H5N1 là 2,9%, và hRSV là 0,1%. Tỷ lệ nhiễm cúm A/H1N1pdm09, A/H1N1 và A/H3N2, cúm B, và A/H5N1 ở bệnh nhân SARI năm 2011 lần lượt là 2,9% (1,1-4,4%), 1,5% (0-2,2%), 3,9% (0-5,8%), và 0,1 (0-0,3%).
Trong khuôn khổ dự án Giám sát và điều tra tình hình dịch ở Đông Nam Á (Surveillance and Investigation of Endemic Situations in South-East Asia - SISEA) tại Bến Tre, tỷ lệ nhiễm cúm A/H1N1pdm09, cúm mùa A, và cúm B tương ứng là 1,4%, 2,7%, và 1,0%. Cúm thường lưu hành vào mùa hè và có hiện tượng chuyển sang tháng 5-7.
1.2.Tổng quan một số vấn đề về sởi
1.2.1. Phép gọi tên và hình thái, cấu trúc
Virus sởi thuộc trên họ Mononegavirales, họ Paramyxoviridae, dưới họ Paramyxovirinae, chi Morbilivirus và tên quốc tế là measles virus.
Hạt virus sởi hoàn chỉnh đa hình thái nhưng chủ yếu hình cầu, kích thước 100-300 nm. Thành phần cấu tạo gồm genome, capsid và vỏ ngoài. Genome là ARN sợi đơn, phân cực âm, không phân đoạn, dài khoảng 16.000 ribonucleotide, có trật tự 3'- N - P - M - F - H - L Polymerase 5'.
1.2.2. Sự nhân lên của virus
Các dòng tế bào thường trực như Vero hay B95a thường được sử dụng để phân lập virus. Toàn bộ quá trình nhân lên của virus sởi xảy ra tại bào tương của tế bào gây nhiễm. Quá trình gắn màng và xâm nhập tế bào của virus xảy ra khi có sự tương tác giữa protein H và F của virus và thụ thể đặc hiệu - phân tử CD46. Sự nhân lên của virus sởi bắt đầu bằng sợi ARN âm ban đầu có vai trò không những làm khuôn mẫu cho quá trình phiên mã thành ARN thông tin để rồi sau đó được dịch mã thành các protein cấu trúc và phi cấu trúc mà còn làm khuôn mẫu để tổng hợp nên ARN sợi âm thế hệ sau thông qua sợi ARN dương trung gian. Sợi ARN âm lắp ráp cùng với các protein cấu trúc. Màng ngoài virus hình thành do quá trình nảy chồi qua màng bào tương và sự giải phóng hạt virus hoàn chỉnh chỉ sau vài giờ.
1.2.3. Các nghiên cứu liên quan đến sởi
Việt Nam đang ở giai đoạn khống chế tiến tới thanh toán sởi. Đã có nhiều hợp tác nghiên cứu cơ bản và ứng dụng như xác định một genotype mới (H2), đặc điểm di truyền các chủng virus sởi hoang dại thời kỳ trước và sau chiến dịch tiêm sởi mũi 2, đánh giá công hiệu vắc xin sởi mũi hai tại Hải Phòng .
Vắc xin phòng sởi hiện nay là vắc xin sống, có thể đơn hoặc phối hợp cùng rubella và quai bị. Thông thường, liều gây miễn dịch là 10[SUP]3[/SUP]-10[SUP]4[/SUP] đơn vị tạo đám hoại tử (Plaque Forming Unit - PFU). Tuổi khuyến cáo tiêm vắc xin sởi từ 6-15 tháng. Trung tâm Nghiên cứu Sản xuất Vắc xin và Sinh phẩm Y tế (POLYVAC) đã sản xuất thành công vắc xin sởi đơn, sống giảm độc lực sử dụng chủng AIK-C. Vắc xin có hiệu giá ổn định, luôn đạt yêu cầu của WHO và vắc xin mẫu chuẩn có hiệu giá 4,2-4,7 Log10/liều 0,5ml. Hiệu giá vắc xin sởi được nhà sản xuất kiểm định bằng phương pháp tạo đám hoại tử (Plaque forming assay – PFA).
1.3.Sản xuất chứng dương ARN và kiểm định công hiệu vắc xin
Vai trò của vắc xin ngày càng lớn, đối tượng phục vụ của vắc xin ngày càng được mở rộng, bao gồm cả phụ nữ có thai, người có tuổi hay trẻ sơ sinh. Đi song hành cùng sự phát triển không ngừng về công nghệ thiết kế và sản xuất vắc xin là sự ra đời của nhiều thử nghiệm kiểm định, trong đó có các kỹ thuật sinh học phân tử.
Đã có nhiều nghiên cứu về ứng dụng real-time trong chẩn đoán, nghiên cứu về sởi và nhiều tác nhân khác. Năm 2006, tác giả Hummel và cộng sự đã thẩm định phương pháp để tìm ra các cặp mồi và đầu dò nhạy và đặc hiệu nhất trong phát hiện sởi. Năm 2006, tác giả Nguyễn Thị Thường và cộng sự đã định lượng số bản sao ADN bên trong tế bào gây nhiễm khi xác định tính kháng thuốc của herpes simplex virus (HSV) với aciclovir và foscarnet nên không cần đợi sự xuất hiện của hủy hoại tế bào (cytopathic effects – CPE) trong khi hiệu giá ADN tương quan chặt chẽ với PFU. Năm 2005, tác giả Schalk và sau này là Ammour và cộng sự đã xây dựng phương pháp mới kiểm định công hiệu sởi của vắc xin sởi phối hợp với rubella và quai bị bằng định lượng trực tiếp số bản sao ARN ở dịch nổi nuôi cấy tế bào. Tuy nhiên, phương pháp này còn nhiều tồn tại, quy trình phức tạp và thời gian gặt ít nhất 2 ngày.
Để định lượng trực tiếp thì nhất thiết phải có gam chuẩn ngoài. Sản xuất ARN bằng phiên mã in vitro giúp tiết kiệm bệnh phẩm, có hiệu giá cao, định lượng được, ổn định, đồng nhất, và tinh khiết. Việt Nam chưa có công bố về sản xuất chứng dương ARN in vitro.