Báo Cáo Nghiên cứu quy trình xác định nhanh vi khuẩn lao và lao kháng thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử

BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI
NĂM 2010
(Báo cáo dài 200 trang khác với bài mã số 212972 chỉ dài 50 trang)

MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ . 1
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 3
1.1. VI KHUẨN LAO VÀ BỆNH LAO 3
1.1.1. Vi khuẩn lao .3
1.1.2. Bệnh lao .9
1.2. DỊCH TỄ PHÂN TỬ CỦA VI KHUẨN LAO VÀ LAO KHÁNG THUỐC .21
1.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN VI KHUẨN LAO 26
1.3.1. Các phương pháp truyền thống 26
1.3.2. Các phương pháp miễn dịch 28
1.3.3. Các phương pháp sinh học phân tử 29
1.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN VI KHUẨN LAO KHÁNG THUỐC 35
1.4.1. Phương pháp xác định kiểu hình 35
1.4.2. Phương pháp xác định kiểu gen 38

CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 47
2.1. VẬT LIỆU .47
2.1.1. Các chủng vi khuẩn lao, mẫu bệnh phẩm và vector .47
2.1.2. Các primer và probe 48
2.1.3. Các hóa chất, nguyên liệu khác 49
2.1.4. Các môi trường, hoá chất sử dụng trong nuôi cấy và xác định vi khuẩn lao 50
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .51
2.2.1. Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học phân tử vi khuẩn lao và vi khuẩn lao kháng thuốc .51
2.2.1.1. Thu thập, bảo quản các chủng vi khuẩn lao và mẫu bệnh phẩm .51
2.2.1.2. Phương pháp thuần nhất mẫu bệnh phẩm đờm .53
2.2.1.3. Nuôi cấy vi khuẩn lao 53
2.2.1.4. Phương pháp kháng sinh đồ xác định tính kháng thuốc 55
2.2.1.5. Tách chiết ADN vi khuẩn lao 56
2.2.1.6. Khuếch đại các đoạn gen đích bằng PCR 57
2.2.1.7. Phương pháp spoligotyping .59
2.2.1.8. Tách dòng gen rpoB và katG phục vụ cho giải trình tự 60
2.2.1.9. Phát hiện đột biến liên quan kháng đa thuốc bằng các phương pháp sinh học phân tử .61
2.2.2. Xây dựng quy trình chẩn đoán phát hiện nhanh vi khuẩn lao và vi khuẩn lao
kháng thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử 62
2.2.2.1. Tạo panel mẫu chuẩn .63
2.2.2.2. Thiết kế các primer nhân các đoạn gen đích 63
2.2.2.3. Thiết kế probe phát hiện tính kháng thuốc 66
2.2.3. Tạo các bộ kit xác định nhanh các chủng vi khuẩn lao và lao kháng thuốc ở Việt Nam 66
2.2.3.1. Tạo bộ kit multiplex PCR chẩn đoán nhanh vi khuẩn lao .66
2.2.3.2. Tạo bộ kit multiplex realtime PCR phát hiện nhanh vi khuẩn lao kháng đa
thuốc 69

CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 71
3.1. ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ PHÂN TỬ VI KHUẨN LAO VÀ LAO KHÁNG THUỐC 71
3.1.1. Thu thập các chủng vi khuẩn lao trên toàn quốc .71
3.1.2. Đặc điểm phân tử vi khuẩn lao ở Việt Nam 72
3.1.3. Đặc điểm phân typ vi khuẩn lao ở Việt Nam .76
3.1.3.1. Mô hình phân tử chủng lao khu vực miền Bắc (spoligotype) 77
3.1.3.2. Mô hình phân tử chủng lao khu vực miền Trung 79
3.1.3.3. Mô hình phân tử chủng lao khu vực miền Nam 81
3.1.4. Đặc điểm phân tử của vi khuẩn lao kháng thuốc ở Việt Nam 83
3.1.4.1. Đặc điểm phân tử của vi khuẩn lao nhạy cảm thuốc .83
3.1.4.2. Đặc điểm phân tử của vi khuẩn lao kháng đơn thuốc 86
3.1.4.3. Đặc điểm phân tử của vi khuẩn lao kháng đa thuốc 89
3.1.4.4. Đặc điểm phân tử của vi khuẩn lao siêu kháng thuốc .91
3.1.5. Dịch tễ học phân tử của vi khuẩn lao Việt Nam .92
3.1.5.1. Phân bố dòng theo khu vực nghiên cứu của vi khuẩn lao Việt Nam 92
3.1.5.2. Phân bố dòng theo đặc điểm kháng thuốc của vi khuẩn lao Việt Nam .95
3.1.5.3. Phân bố dòng theo đặc điểm kháng thuốc và theo khu vực của vi khuẩn lao Việt Nam .97
3.1.5.4. Phân bố chủng lao Việt Nam theo tuổi và giới tính bệnh nhân và theo khu vực 100
3.1.5.5. Phân bố chủng lao Việt Nam theo tuổi bệnh nhân và mức độ kháng thuốc 103
3.1.5.6. Mối liên quan giữa phân bố dòng vi khuẩn lao Việt Nam và tuổi bệnh nhân .105
3.1.5.7. Mức độ kháng thuốc của vi khuẩn lao Việt Nam theo dòng .108
3.1.5.8. Mức độ kháng thuốc của vi khuẩn lao Việt Nam theo dòng và theo khu vực .110
3.1.6. Đặc điểm đột biến ở các gen liên quan kháng thuốc của vi khuẩn lao ở Việt Nam .111
3.1.6.1. Phát hiện đột biến trên gen katG .112
3.1.6.2. Phát hiện đột biến trên gen rpoB 117
3.2. XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN NHANH VI KHUẨN LAO VÀ
LAO KHÁNG THUỐC BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ .124
3.2.1. Xây dựng quy trình chẩn đoán nhanh vi khuẩn lao 124
3.2.1.1. Xây dựng quy trình tách chiết ADN của vi khuẩn lao 124
3.2.1.2. Tạo panel mẫu chuẩn .127
3.2.1.3. Quy trình multiplexPCR chẩn đoán nhanh vi khuẩn lao .129
3.2.2. Xây dựng quy trình chẩn đoán nhanh vi khuẩn lao kháng thuốc .141
3.2.2.1. Quy trình chẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc bằng giải trình tự ADN .141
3.2.2.2. Quy trình chẩn đoán nhanh vi khuẩn lao kháng thuốc bằng realtime PCR .150
3.3. XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHẾ TẠO CÁC BỘ KIT XÁC ĐỊNH NHANH CÁC CHỦNG VI KHUẨN LAO VÀ LAO KHÁNG THUỐC Ở
VIỆT NAM 163
3.3.1. Xây dựng quy trình chế tạo bộ kit xác định nhanh vi khuẩn lao 163
3.3.1.1. Tạo master mix 163
3.3.1.2. Nghiên cứu thử nghiệm độ nhạy, độ đặc hiệu và ngưỡng phát hiện của
phản ứng multiplex PCR trên panel mẫu 163
3.3.1.3. Đánh giá hiệu quả chẩn đoán của kit mPCR trên mẫu bệnh phẩm lâm sàng .166
3.3.2. Kết quả chế tạo thử nghiệm kit multiplex PCR 171
3.3.3. Kiểm tra tính ổn định của kit multiplex PCR .172
3.3.4. Chứng nhận bảo hộ quyền sở hữu trí tuệ .175
3.3.5. Xây dựng quy trình và sản xuất kit chẩn đoán phát hiện nhanh vi khuẩn lao
kháng đa thuốc 176
3.3.5.1. Chế tạo thử nghiệm kit realtime PCR 176
3.3.5.2. Nghiên cứu thử nghiệm, đánh giá kit realtime PCR trên panel mẫu chuẩn 178

CHƯƠNG IV. KẾT LUẬN .183
4.1. Dịch tễ học phân tử vi khuẩn lao và lao kháng thuốc 183
4.2. Xây dựng được một số quy trình chẩn đoán nhanh vi khuẩn lao và vi khuẩn lao kháng thuốc 183
4.3. Chế tạo được một số bộ kit chẩn đoán nhanh vi khuẩn lao và vi khuẩn lao kháng thuốc .184
CÁC KẾT QUẢ KHÁC 184
KIẾN NGHỊ 184
TÀI LIỆU THAM KHẢO .185
MỞ ĐẦU
Lao là một bệnh truyền nhiễm và đã từng được Tổ chức y tế thế giới (WHO) khuyến cáo về tình trạng khẩn cấp toàn cầu. Vi khuẩn lao
(Mycobacterium tuberculosis) hiện đang gây nhiễm cho khoảng 1/3 dân số thế giới (hơn 2 tỷ người) và ước tính mỗi năm có khoảng 8 triệu trường hợp nhiễm mới và 2 triệu người chết [70].
Việt Nam đứng thứ 12 trong số 22 quốc gia có gánh nặng bệnh nhân lao cao trên thế giới. Một trong những nhân tố góp phần gia tăng bệnh lao là những khó khăn trong quá trình chẩn đoán. Phát hiện nhanh vi khuẩn lao dựa vào phương pháp nhuộm Ziehl-Neelsen các mẫu bệnh phẩm nghi lao, nhiều trường hợp cho âm tính giả khi số lượng vi khuẩn lao ≤ 104 vi khuẩn/ml. Nuôi cấy vi khuẩn lao được coi là tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán nhưng trên môi trường Lowenstein phải mất khoảng 4-8 tuần mới cho kết quả. Trên hệ thống nuôi cấy cải tiến MGIT, BACTEC mất khoảng 2 tuần, nếu làm kháng sinh đồ mất thêm ít nhất 2 tuần nữa, do vậy khó đáp ứng yêu cầu giám sát và thanh
toán bệnh lao [62]. Hiện nay, nhờ áp dụng các phương pháp sinh học phân tử vào chẩn đoán vi khuẩn lao và vi khuẩn lao kháng thuốc, khắc phục được đặc điểm mọc rất chậm của vi khuẩn lao, rút ngắn thời gian chẩn đoán lao từ 4-8 tuần theo cách nuôi cấy tự nhiên xuống còn 2-4 ngày. Kỹ thuật sinh học phân tử được sử dụng rộng rãi nhất là phản ứng PCR khuếch đại gen đích IS6110, đây là một trình tự chèn (IS - Insertion Sequence) có nhiều bản copy (khoảng 4-20 bản copy) đặc hiệu cho chủng Mycobacterium tuberculosis complex. Việt Nam hiện có một vài công ty xây dựng kít thương phẩm chẩn đoán vi khuẩn lao sử dụng gen đích là IS 6110 như công ty Nam Khoa, Việt Á. Tuy
nhiên, một số nghiên cứu gần đây cho thấy có khoảng 5-8% chủng lao tại Đông Nam châu Á, Việt Nam và Ấn Độ khuyết đoạn gen này trong bộ gen [24] [27] [63] [37] [68], vì vậy một số xét nghiệm cho kết quả âm tính giả.
Nhằm khắc phục tình trạng trên, một số tác giả trên thế giới đề xuất sử dụng một số gen đích khác trong PCR chẩn đoán vi khuẩn lao như IS1081; 23S rDNA [24] [68] [62]. Nhưng cho đến nay chưa có tác giả nào trong nước đề xuất hoặc công bố quy trình PCR mới cho chẩn đoán vi khuẩn lao ở Việt Nam. Đặc biệt, tình hình kháng thuốc của vi khuẩn lao tại Việt Nam đang là một vấn đề đáng lo ngại. Theo Chương trình Chống lao Quốc gia năm 2006, tỷ lệ kháng thuốc tiên phát là 32,5% vào loại cao trên thế giới. Tỷ lệ kháng đa thuốc chung là 4%, trong đó tỷ lệ đa kháng thuốc thứ phát là 19,3%, tỷ lệ đa kháng thuốc tiên phát là 2,7%. Ước tính đến 2015, số ca tử vong do lao khoảng 14.000 người. Trong đó kháng với rifampicin và isoniazid được quan tâm nhất, vì đây là những kháng sinh chủ lực trong phác đồ điều trị lao. Việc
chẩn đoán và điều trị lao kháng thuốc gặp rất nhiều khó khăn, tốn kém cả về vật chất, công sức và thời gian. Trên thế giới, một số kít thương phẩm chẩn đoán nhanh vi khuẩn lao kháng thuốc như INNO-LIPA RMP TB kit (Bỉ); Geno type MTB assay kit (Đức) Tuy nhiên hiện nay chưa có dữ liệu đầy đủ về đặc điểm phân tử của vi khuẩn lao kháng đa thuốc ở Việt Nam nên không có cơ sở để sử dụng kit này, hơn nữa giá thành các bộ kít thương mại này không phù hợp với điều kiện kinh tế Việt Nam. Hiện trong nước chưa có kit thương phẩm chẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc, do vậy việc nghiên cứu và phát triển kit chẩn đoán lao và lao kháng thuốc ở Việt Nam là cần thiết.
Vì vậy, đề tài này được đặt ra nhằm vào các mục tiêu sau:
1. Đặc điểm dịch tễ học phân tử của vi khuẩn lao và vi khuẩn lao kháng đa thuốc.
2. Xây dựng qui trình xác định nhanh các chủng vi khuẩn lao và lao kháng thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử.
3. Xây dựng qui trình chế tạo các bộ kit xác định nhanh các chủng vi khuẩn lao và lao kháng thuốc ở Việt Nam.