Tiến Sĩ Nghiên cứu quy trình tạo sinh khối tế bào thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.) để chiết xuất hoạt chất

LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC
NĂM 2013


MỤC LỤC
Trang
Trang phụ bìa
Lời cảm ơn
Lời cam đoan
Mục lục
Danh mục chữ viết tắt trong luận án
Danh mục các bảng
Danh mục các hình
ĐẶT VẤN ĐỀ .1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU. .3
1.1. CÂY THÔNG ĐỎ .3
1.1.1. Tên khoa học . 3
1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố 3
1.1.3. Thành phần hóa học .5
1.1.4. Tác dụng sinh học .9
1.1.5. Các thuốc điều trị ung thư nguồn gốc từ thông đỏ .9
1.2. CÔNG NGHỆ SINH KHỐI TẾ BÀO THỰC VẬT 11
1.2.1. Khái niệm, ưu điểm và khó khăn khi triển khai .11
1.2.2. Quy trình tạo sinh khối tế bào thực vật 13
1.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng tới sự phát triển tế bào và hàm lượng hoạt
chất trong nuôi cấy tế bào thực vật .15
1.3.1. Nhu cầu nguồn nguyên liệu paclitaxel trong điều trị ung thư 21
1.3.2. Sản xuất paclitaxel bằng công nghệ sinh khối tế bào thực vật 22
1.3.3. Phương pháp định lượng paclitaxel và các dẫn chất sử dụng trong
đánh giá chất lượng sinh khối tế bào thông đỏ 28
1.3.4. Các phương pháp chiết xuất phân lập paclitaxel từ sinh khối tế bào
thông đỏ 29

CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.31
2.1. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 31
2.1.1. Nguyên liệu và hoá chất .31
2.1.2. Thiết bị nghiên cứu .31
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .32
2.2.1. Xây dựng qui trình tạo sinh khối thông đỏ .32
2.2.2. Nghiên cứu thành phần hoá học và chiết xuất phân lập một số chất
chính, xây dựng TCCS của nguyên liệu sinh khối tế bào thông đỏ .36
2.2.3. Phương pháp phân tích xử lý kết quả nghiên cứu 41

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 42
3.1. XÂY DỰNG QUY TRÌNH TẠO SINH KHỐI TẾ BÀO THÔNG ĐỎ 42
3.1.1. Tạo callus thông đỏ 42
3.1.2. Duy trì nuôi cấy callus thông đỏ trong môi trường thạch 48
3.1.3. Kết quả nuôi cấy trong môi trường lỏng 52
3.1.4. Kết quả nuôi cấy trên hệ thống bioreactor 5 lít 64
3.1.5. Kết quả nghiên cứu thu hoạch sinh khối tế bào thông đỏ 65
3.2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC, CHIẾT XUẤT
PHÂN LẬP, XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CỦA SINH KHỐI TẾ BÀO
THÔNG ĐỎ 70
3.2.1. Xác định thành phần hóa học trong sinh khối tế bào thông đỏ 70
3.2.2. Chiết xuất phân lập và nhận dạng một số chất chính trong sinh
khối tế bào thông đỏ .81
3.2.3. Chiết xuất, tinh chế paclitaxel trong sinh khối tế bào thông đỏ .89
3.2.4. Kết quả nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của nguyên liệu
sinh khối tế bào thông đỏ và hoạt chất .97

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN . 104
4.1. QUY TRÌNH TẠO SINH KHỐI TẾ BÀO THÔNG ĐỎ .104
4.1.1. Về nuôi cấy tạo callus thông đỏ .104
4.1.2. Về duy trì nuôi cấy callus thông đỏ trong môi trường thạch .108
4.1.3. Về nuôi cấy tế bào thông đỏ trong môi trường lỏng 111
4.1.4. Về nuôi cấy tế bào thông đỏ trên hệ thống bioreactor 5 lít 124
4.1.5. Về quy trình thu hoạch sinh khối tế bào thông đỏ .126
4.2. NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC, CHIẾT XUẤT PHÂN
LẬP, XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CỦA SINH KHỐI TẾ BÀO
THÔNG ĐỎ 126
4.2.1. Về nghiên cứu thành phần hóa học 126
4.2.2. Về chiết xuất, phân lập và nhận dạng các chất chính có trong sinh
khối tế bào thông đỏ .129
4.2.3. Về chiết xuất, tinh chế paclitaxel trong sinh khối tế bào thông đỏ130
4.2.4. Về kết quả xây dựng TCCS của sinh khối tế bào thông đỏ .133
KẾT LUẬN . .135
KIẾN NGHỊ .137
CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN
QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 138
TÀI LIỆU THAM KHẢO 139
PHẦN PHỤ LỤC .155

ĐẶT VẤN ĐỀ
Thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.) là dược liệu quý phân bố chủ
yếu tại khu vực dãy núi Hymalaya. Ở Việt Nam, thông đỏ được tìm thấy tại
các huyện Đức Trọng, Đơn Dương, Lạc Dương và Thành phố Đà Lạt tỉnh
Lâm Đồng ở độ cao từ 1.300 m đến 1.700 m với số lượng cá thể nhỏ. Từ
lâu, trong dân gian đã dùng lá của loài cây này để trị hen suyễn, viêm phế
quản, nấc, tiêu hoá .; cành và vỏ dùng trị bệnh thực tích, giun đũa; nước sắc
của thân non dùng trị bệnh đau đầu . Đặc biệt, trong thông đỏ có thể tìm
thấy các hoạt chất có tác dụng ức chế tế bào ung thư như: paclitaxel (taxol),
cephalomannin hoặc các chất có thể bán tổng hợp ra các thuốc điều trị ung
thư như baccatin III, 10-deacetyl baccatin III, deacetyl taxol . Tuy nhiên,
thông đỏ là loài cây sinh trưởng chậm, trong khi hàm lượng hoạt chất trong
cây thấp. Theo tính toán của các nhà khoa học, để điều trị khỏi cho một
bệnh nhân cần sử dụng nguồn dược liệu tương đương với 8 cây thông đỏ 60
năm tuổi [125]. Vì vậy, nguồn nguyên liệu từ cây tự nhiên khó đáp ứng đủ
nhu cầu điều trị ngày càng tăng, đồng thời việc khai thác từ cây tự nhiên dẫn
đến cạn kiệt và có nguy cơ tiệt chủng loại dược liệu quý hiếm này [125].
Ở Việt Nam, các nhà khoa học đã nhân giống thành công và trồng
rộng rãi thông đỏ tại Đà Lạt để lấy lá sử dụng chiết xuất 10-deacetyl
baccatin III làm nguyên liệu bán tổng hợp paclitaxel và docetaxel [6]. Hiện
nay, Bộ Khoa học Công nghệ đã cho phép triển khai nhiều đề tài, dự án về
nghiên cứu chiết xuất phân lập cũng như sản xuất thuốc tiêm paclitaxel từ
nguồn dược liệu thông đỏ ở Việt Nam nhằm mục đích tạo ra sản phẩm thuốc
điều trị ung thư phục vụ cộng đồng. Bên cạnh đó việc ứng dụng công nghệ
sinh khối tế bào thực vật để sản xuất các hoạt chất từ dược liệu nói chung và
thông đỏ nói riêng cũng là hướng nghiên cứu mới có triển vọng [125].
2
Công nghệ sinh khối tế bào thực vật là công nghệ nuôi cấy các tế bào
trong điều kiện vô khuẩn trong ống nghiệm hay các bình nuôi cấy lớn, nhằm
mục đích tạo ra khối lượng tế bào từ đó có thể sử dụng để tách chiết các
hoạt chất [46], [53]. Công nghệ sinh khối tế bào có ưu điểm so với việc gieo
trồng ngoài tự nhiên là: thời gian từ khi nuôi cấy tới khi thu hoạch ngắn,
không chịu ảnh hưởng của các yếu tố ngoại cảnh như khí hậu, thời tiết, dịch
bệnh, thời vụ; chất lượng nguyên liệu ổn định, hàm lượng hoạt chất có thể
được cải thiện hơn so với trồng ngoài tự nhiên. Công nghệ này rất thích hợp
cho việc sản xuất các chất trong thực vật có cấu trúc hoá học phức tạp khó
tổng hợp bằng con đường hoá học hoặc các chất có hàm lượng thấp trong
cây tự nhiên. Từ công nghệ sinh khối tế bào thực vật, các nhà khoa học đã
cung cấp cho thị trường những sản phẩm có giá trị phục vụ cho ngành công
nghiệp Dược phẩm và thực phẩm [9], [53].
Với mục đích góp phần tạo thêm nguồn nguyên liệu sản xuất
paclitaxel từ nguồn dược liệu thông đỏ ở Việt Nam theo hướng ứng dụng
công nghệ sinh khối tế bào thực vật, đề tài: “Nghiên cứu quy trình tạo sinh
khối tế bào thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.) để chiết xuất hoạt chất
điều trị ung thư” được tiến hành nhằm các mục tiêu:
1. Xây dựng được qui trình tạo sinh khối tế bào thông đỏ qui mô phòng
thí nghiệm.
2. Xác định được thành phần hoá học, chiết xuất, phân lập một số chất
chính và xây dựng tiêu chuẩn cơ sở nguyên liệu sinh khối tế bào thông đỏ
tạo ra.